摘要
甜菜素是一种水溶性含氮天然色素，具有多种生物活性功能，在食品、化工、印染、日化、医药、饲料等领域中广泛的应用前景。目前，甜菜素生物合成途径中的结构基因在积累甜菜素的植物中已有较多报道，但关于其调控机制报道很少。MYB类和WRKY类转录因子在植物生长发育、生理代谢、抗逆反应和激素信号转导中发挥重要作用。火龙果果实中含有丰富的甜菜素，然MYB类和WRKY类转录因子如何调控甜菜素生物合成机制尚不清楚。本研究基于‘莞华红’(红皮红肉)火龙果果实发育不同时期转录组数据，采用生物信息学、时空表达、亚细胞定位、酵母双杂、双荧光素酶报告、VIGS等方法筛选和鉴定参与甜菜素生物合成的MYB类和WRKY类转录因子，并对其功能进行初步解析，以期阐明MYB类和WRKY类转录因子调控火龙果甜菜素生物合成的分子机制。主要研究结果如下： 1、基于火龙果转录组数据库获得了144个MYB和73个WRKY类转录因子，根据FPKM值的变化趋势筛选到7个MYB类和6个WRKY类转录因子可能参与甜菜素的生物合成途径。根据甜菜素含量与实时荧光定量结果，得到2个MYB(HpMYB39和HpMYB-like)和3个WRKY(HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40)候选转录因子与甜菜素生物合成相关。 2、克隆了HpMYB39、HpMYB-like、HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40基因的全长cDNA序列，序列分析表明，HpMYB39是R2R3-MYB转录因子；HpMYB-like属于MYB-related家族；HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40属于WRKY家族第II类。亚细胞定位实验结果表明，这5个基因均定位在细胞核上。 3、实时荧光定量结果显示，HpMYB39、HpMYB-like、HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40与甜菜素生物合成结构基因HpCytP450-like1、HpCytP450-like2、HpCytP450-like4和HpGT-like2的表达趋势一致。沉默HpMYB39、HpMYB-like、HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40转录因子后，火龙果鳞片着色比对照晚，甜菜素含量显著降低。 4、酵母单杂和双荧光素酶实验结果表明，HpMYB-like可以通过结合并激活HpCytP450-like1和HpCytP450-like4启动子的活性，进而转录调控甜菜素的生物合成；HpMYB39和HpWRKY40可以结合并激活HpCytP450-like1启动子的活性，进而转录调控火龙果中甜菜素的生物合成。 综上所述，HpMYB39、HpMYB-like、HpWRKY7、HpWRKY31和HpWRKY40与甜菜素的生物合成相关，其中HpMYB39、HpMYB-like和HpWRKY40有选择性的调控甜菜素生物合成相关结构基因的表达，参与转录调控甜菜素的生物合成。
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