摘要
黄梁木(Neolamarckia cadamba)作为速生树种之一，目前有关其速生性的分子机制研究还很少。植物细胞的生长受到细胞壁的限制，扩展蛋白(expansin, EXP)是一种细胞壁生长调节因子，在细胞壁修饰和细胞扩展过程中发挥着重要的作用，与植物的生长发育密切相关。本研究将黄梁木NcEXPA8蛋白与拟南芥26个EXPA蛋白进行系统进化树构建，结果发现NcEXPA8与拟南芥的EXPA蛋白的A亚家族属于同一分支，因此，本研究选择了拟南芥EXPA蛋白的A亚家族的AtEXPA3、AtEXPA4、AtEXPA6、AtEXPA9和AtEXPA16的基因突变体开展实验，揭示了A亚家族基因的功能冗余且说明了NcEXPA8基因具有与AtEXPAs亚家族A基因相似的功能。同时，对黄梁木种子和转NcEXPA8基因的拟南芥种子进行萌发试验，表明NcEXPA8基因可能参与了黄梁木种子萌发的过程。通过上述研究，创制了拟南芥EXPA多基因突变体材料和为在黄梁木中进行基因NcEXPA8的功能研究奠定基础，主要结果如下： 1.通过三引物法鉴定得到拟南芥单基因突变体atexpa3、atexpa4、atexpa6、atexpa9和atexpa16，将atexpa4与atexpa16两个纯合突变体进行杂交，得到atexpa4/16双基因突变纯合体。但与野生型相比，单基因突变体和双基因突变体均没有明显的表型差异。 2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建拟南芥EXPA多基因编辑载体pHEE401E-AtEXPA3/6/9，转化拟南芥双基因突变纯合体atexpa4/16，筛选得到纯合非转基因植株的三基因突变纯合体atexpa3/4/16、atexpa4/6/16，四基因突变纯合体atexpa3/4/6/16；构建pHEE401E-AtEXPA9载体转化四基因突变纯合体atexpa3/4/6/16，筛选得到纯合非转基因的五基因突变纯合体atexpa3/4/6/9/16。 3.利用荧光定量RT-qPCR技术，对三基因突变体atexpa3/4/16、atexpa4/6/16，四基因突体atexpa3/4/6/16的各个突变基因进行表达量分析，结果表明在莲座叶和花序茎中，相应突变体的突变基因的表达量均有不同程度的下降。 4.对多基因突变体atexpa3/4/16、atexpa4/6/16、atexpa3/4/6/16进行表型观察，与野生型相比，多基因突变体均出现了明显的生长抑制，莲座面积变小，叶片数量减少，植株矮化，花序茎粗度变小，下胚轴的长度变短但其纵向表皮细胞数目没有明显变化，下胚轴的缩短主要是由细胞的变短引起的，但是不同突变体的生长抑制程度不完全相同。 5.对多基因突变体atexpa3/4/16、atexpa4/6/16、atexpa3/4/6/16进行显微结构分析，与野生型相比，在多基因突变体花序茎横切结构中，其皮层显著变薄，皮层细胞显著变小；在下胚轴横切结构中，多基因突变体的下胚轴生长均受到抑制，木质部不发达甚至出现生长缺陷。 6.将黄梁木基因NcEXPA8在拟南芥多基因突变体atexpa3/4/16、atexpa4/6/16、atexpa3/4/6/16中过表达，结果发现三个过表达株系的莲座面积显著大于相对应的突变体，叶片数量增多，株高也有一定程度的恢复，部分表型恢复至野生型。 7.在黄梁木种子萌发试验中，在种子刚萌发时基因NcEXPA8的表达量最高，随后，胚根不断发育，但表达量却显著降低，且保持在较低的水平。在三个转NcEXPA8基因的拟南芥株系萌发的种子中，基因NcEXPA8都有很高的表达量，显著地高于其他在种子萌发中特异表达的内源基因，但过表达NcEXPA8基因并未影响这些基因的表达，基因NcEXPA8的过表达还降低了拟南芥种子对ABA的敏感性，提高了其对GA的敏感性。
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