摘要
芥蓝具有重要的营养价值和经济价值，是华南地区的重要特色蔬菜。芥蓝性喜冷凉，不耐高温，其生长发育和菜薹形成均偏好较低的温度。然而，夏季的广东地区持续高温，导致芥蓝的生长发育缓慢甚至停滞，严重影响芥蓝的正常生产。挖掘利用芥蓝基因组中的耐热性基因，可以更好地了解芥蓝的高温响应机制，为耐热栽培和耐热芥蓝品种培育奠定基础。在前期高温胁迫处理转录组分析的基础上，本研究筛选到一个高温诱导的抗坏血酸过氧化物酶基因BaAPX2，利用荧光定量PCR分析了BaAPX2基因在芥蓝不同组织中的表达水平以及高温处理不同时间点的表达量。进一步克隆芥蓝BaAPX2基因，通过生物信息学分析，探究芥蓝BaAPX2蛋白的基本理化性质及同源进化关系。构建过表达载体，转化到拟南芥中。通过构建BaAPX2-GFP融合载体，利用荧光显微镜确定BaAPX2的亚细胞定位。主要结果如下： 1.分别在37℃高温胁迫0、1、3、6、12h取样，发现随着高温处理时间的延长，BaAPX2基因的表达量相比于对照都有所增加。在处理1h时基因表达量显著增加，后随高温处理时间的延长逐渐降低，但总体表现为上调趋势。对BaAPX2基因在芥蓝根、茎、叶、花蕾、花中进行表达分析显示，BaAPX2基因在植物组织中的表达含量都不是很高，但相对而言，在根中的表达量最高，达到显著性差异水平，其次是茎，在花中的表达量最低。 2.利用分子生物学技术从芥蓝中成功克隆到BaAPX2基因全长。生物信息学分析表明，BaAPX2基因的ORF长755bp，编码251个氨基酸，含有8个内含子和9个外显子，且是一个比较稳定的亲水性蛋白。在蛋白质二、三级结构预测中，BaAPX2蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲的形式存在。BaAPX2蛋白不存在信号肽，因此不属于分泌蛋白，也没有跨膜结构域，不是膜蛋白。通过WOLFPSORT预测BaAPX2的亚细胞定位，主要定位于细胞质中。通过对蛋白的氨基酸同源比对分析发现，芥蓝BaAPX2与甘蓝、不结球白菜APXs的同源性较高；利用NJ法构建进化树也得到芥蓝与十字花科的甘蓝、不结球白菜、花椰菜亲缘关系最近，说明APX在近缘种属间高度保守。 3.通过构建瞬时表达载体pcambia1300-GFP-C-BaAPX2将活化后的农杆菌注射到烟草叶片下表皮细胞中，利用荧光显微镜观察荧光，发现该GFP绿色荧光分布在细胞质中。 4.为了进一步探索BaAPX2基因所编码蛋白的功能及其在拟南芥中所起的耐热作用，成功构建了pcambia1302-BaAPX2过表达载体。利用冻融法转化农杆菌，并将活化的农杆菌喷在拟南芥未开的花苞上。收种后，通过潮霉素筛选，对潮霉素和目的基因分别进行PCR检测，获得18株转基因拟南芥T0代植株和空载体拟南芥T0代植物。
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