摘要
奶牛乳房炎是全球最难防治的奶牛疾病之一，全世界每年因奶牛乳房炎造成的损失巨大，其病原菌种类繁多，不同病原菌致病性方面的研究深浅不一。目前，多个国家报道从奶牛乳房炎的奶样中分离到了柠檬酸杆菌，本实验室也曾从乳样中分离到克氏柠檬酸杆菌。为了解克氏柠檬酸杆菌在陕西奶牛乳房炎的流行状况及其吲哚tnaA基因的功能开展了本试验。1、采集陕西省4个规模化牛场奶牛乳房炎患病牛乳样，进行克氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定。2、将分离到的克氏柠檬酸杆菌的吲哚基因tnaA作为靶标，以该野生菌株基因组为模板，采用重叠PCR方法将tnaA上下游同源臂融合，将tnaA克隆到自杀性质粒(pRE112)上，构建重组自杀性质粒(pREΔtnaA)，以野生菌株为受体菌，含pREΔtnaA的X7213为供体菌进行共培养，运用两步法筛选出缺失株ΔtnaA，使用pBBR1MCS-1质粒对ΔtnaA进行回补。3、对野生株、缺失株ΔtnaA、回补株ΔtnaA-A三株菌的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、抗酸性、毒力等进行检测。结果显示：1、本试验采集了陕西4个奶牛场212份乳样，分离到1株疑似克氏柠檬酸杆菌的细菌，将其16SrRNA基因PCR扩增产物进行测序比对，它与克氏柠檬酸杆菌的同源性大于99%，确定此分离株为克氏柠檬酸杆菌。2、采用自杀性质粒pRE112介导的同源重组，对克氏柠檬酸杆菌的吲哚结构基因tnaA进行敲除，成功构建了缺失株ΔtnaA，并且利用广宿质粒pBBR1MCS-1，成功构建了ΔtnaA的回补菌株ΔtnaA-A。3、缺失株ΔtnaA较野生株生物被膜形成能力降低、运动直径减小，运动性减弱、缺失株ΔtnaA的LD50是野生株的22.49倍，毒力下降、抗酸性能力减弱，回补株ΔtnaA-A基本恢复其原有生理特性。由以上结果得出结论：克氏柠檬酸杆菌在被调查牛场乳房炎中感染率低，4个牛场乳样中仅分离到1株；克氏柠檬酸杆菌吲哚tnaA基因参与细菌毒力、生物被膜、运动性、抗酸性等的多种生理活动，为揭示该菌引起奶牛乳房炎的机理提供了资料。
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