摘要
目的： 探究铁过载(IO)及其相关信号通路对骨髓增生异常综合征(MDS)患者间充质干细胞(MSC)功能的影响，揭示铁过载损伤MDS造血微环境的可能机制。 内容： 实验纳入天津医科大学总医院血液科2017年11月至2019年8月收治的初治MDS患者53例，健康对照者(NC)12例，其中MDS患者根据血清铁蛋白是否大于等于1000ng/ml分为铁过载组(IO)和非铁过载组(NIO)。取上述实验对象无菌骨髓5ml，经体外诱导培养MSC。观察MSC基本特点，检测细胞凋亡水平；检测细胞内铁沉积情况及DMT1和ZIP14等铁代谢相关基因水平；检测活性氧(ROS)、低氧诱导因子(HIF-1α)及其降解关键酶脯氨酸羟化酶(PHD2)等铁过载下游通路分子水平；最后检测IL-6、IL-8、VEGF、TGFβ等MSC相关细胞因子水平以及对IO组MSC给予祛铁及抗氧化处理后上述相关指标的变化情况。 方法： 1.收集初治MDS患者及健康志愿者骨髓标本，采用梯度离心法分离提取骨髓单个核细胞(BMMCs)，体外诱导培养MSC至第二代或第三代用于后续相关实验。 2.倒置显微镜观察MSC形态；流式细胞术(FCM)检测MSC纯度、细胞凋亡及ROS水平。 3.采用RT-PCR方法检测MSC内DMT1及ZIP14铁代谢相关基因表达水平，检测HIF-1α、PHD2等ROS下游信号分子基因表达水平，检测IL-6、IL-8、VEGF、TGFβ等相关细胞因子水平。 4.采用蛋白免疫印迹(WB)检测MSC内HIF-1α及PHD2蛋白水平。 5.对IO组MSC分别给予去铁胺(DFO)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)祛铁和抗氧化处理，检测上述铁过载相关ROS、铁代谢指标、HIF-1α及PHD2及相关细胞因子水平变化情况。 结果： 1.MSC基本特征 采用FCM检测MSC纯度，结果证实MSC中CD73+CD90+CD105+CD34-CD45-MSC比例在90%以上。倒置显微镜观察MSC形态发现MDS-MSC与NC-MSC相比，细胞数量明显减少，细胞形态呈扁平状、突起少、排列杂乱。FCM检测MSC凋亡发现MDS-MSC尤其是IO-MDS-MSC凋亡水平(42.57±2.78%)显著高于NC组(19.92±1.80%，p<0.0001)及NIO组(30.48±2.19%，p=0.0011)。 2.MSC铁代谢水平 铁染色检测细胞内铁沉积情况，发现MDS-MSC尤其是IO-MDS-MSC细胞数量明显减少且胞质内有明显蓝黑色铁颗粒沉积。PCR检测铁代谢相关基因DMT及ZIP14，结果表明DMT1基因表达量在IO组(1.43±0.13)显著高于NC(0.93±0.09，p=0.0100)及NIO组(1.07±0.11，p=0.0393)；ZIP14基因表达量在IO组(1.66±0.15)明显高于NC(0.89±0.10，p=0.0019)及NIO组(1.14±0.13，p=0.0114)。上述结果证实MDS铁过载患者MSC自身铁代谢也会发生改变，铁吸收能力增加，细胞内铁水平升高。 3.铁过载引起MSC内ROS水平升高 FCM检测MSC内ROS水平，结果证实IO组MSC内ROS平均荧光强度(9.72±0.47*105)显著高于NC(6.74±0.30*105,p<0.0001)及NIO组(7.90±0.36*105,p=0.0035)。结果表明MDS-MSC细胞内铁水平升高后会导致ROS水平升高，损伤细胞功能。 4.ROS可以通过抑制MSC内PHD2导致HIF-1α水平升高 采用PCR方法检测MSC内PHD2及HIF-1α基因表达情况，IO组HIF-1α基因表达量(1.97±0.18)显著高于NC(0.88±0.11，p=0.0003)及NIO组(1.44±0.12,p=0.0165)，HIF-1降解途径的关键酶PHD2基因表达水平在IO组(0.68±0.07)明显低于NIO(0.91±0.07，p=0.0279)及NC组(1.05±0.11，p=0.0050)。进一步对IO-MDS-MSC内ROS水平及HIF-1α基因表达水平进行相关性分析，结果证实IO-MDS-MSC内ROS水平与HIF-1α基因表达量存在正相关(r=0.563，p=0.002)。采用WB评估各组MSC内HIF-1α及PHD2蛋白水平，结果显示IO-MSC与NC及NIO组相比，HIF-1α蛋白水平明显升高，PHD2蛋白水平明显降低。以上实验结果表明MDS铁过载导致ROS水平升高后，可以通过抑制PHD2水平导致MSC内HIF-1α水平升高，HIF-1α可与HIF-1β结合形成HIF-1发挥作用。 5.HIF-1升高可导致MSC内细胞因子水平变化 采用KEGG生物信息数据库分析HIF-1下游通路及相关分子，选取与MSC及MDS疾病相关的细胞因子，最终确定IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β等与炎性反应、骨髓造血及MDS转白相关的四个因子作为实验检测细胞因子。采用PCR方法检测上述细胞因子表达情况，结果显示炎性细胞因子IL-6在IO-MDS-MSC中表达量(2.03±0.18)明显高于NC(0.97±0.11，p=0.0003)及NIO组(1.54±0.14，p=0.0342)；与MDS疾病进展相关的细胞因子IL-8在IO-MDS-MSC中表达量(1.64±0.14)显著高于NC(1.04±0.08，p=0.0058)；与MDS转白相关的细胞因子VEGF在IO-MDS-MSC中表达量(1.80±0.17)明显高于NC(0.98±0.08，p=0.0022)及NIO组(1.35±0.12，p=0.0360)；与造血负调控及免疫抑制相关的细胞因子TGF-β在IO-MDS-MSC(1.82±0.16)中表达量明显高于NC(0.96±0.07，p=0.0007)及NIO(1.32±0.10,p=0.0098)组。上述结果表明，MDS-MSC中HIF-1α水平升高会导致MSC内相关细胞因子水平发生变化 6.祛铁及抗氧化处理可以降低MSC内相关细胞因子水平 选取IO-MDS-MSC(n=10)分别给予DFO和NAC进行去铁及抗氧化处理，结果显示处理后细胞内凋亡水平与处理前相比有所下降(DFO组p=0.0143;NAC:组p=0.0043)ROS水平较处理前下降(DFO组p=0.0356;NAC:组p=0.0430)，PHD2水平较前恢复(DFO组p=0.0457,NAC组p=0.0462)，HIF-1α水平较处理前下降(DFO组p=0.0333,NAC组p=0.0415)，IL-6(DFO组p=0.0163,NAC组p=0.0498)、IL-8(DFO组p=0.0031,NAC组p=0.0008)、TGFβ(DFO组p=0.0403,NAC组p=0.0355)VEGF(DFO组p=0.0222,NAC组p=0.0458)四种细胞因子表达量均较处理前明显下降。 结论： 1.MDS患者尤其是铁过载MDS患者BM-MSC数量明显减少，且细胞形态不规则，呈扁平状、突起少、排列杂乱。 2.MDS患者处于铁过载状态下会影响骨髓微环境，导致BM-MSC铁吸收能力增强，细胞内铁水平增加，进一步引起ROS水平升高，ROS具有超强氧化还原活性，可以通过氧化应激损伤细胞功能。 3.MDS铁过载导致细胞内ROS水平升高，可以抑制PHD2活性，进一步导致HIF-1α降解受抑，在胞质内与HIF-1β结合，最终导致HIF-1水平升高。 4.HIF-1下游通路分子如IL-6、IL-8、TGFβ、VEGF等，具有促炎、促进血管生成、抑制免疫及骨髓造血等功能，HIF-1水平升高会引起MSC内这四种细胞因子水平也相应升高，使MSC功能发生改变，影响MDS骨髓微环境，可能与参与MDS转白机制。 5.祛铁及抗氧化处理可以减少IO-MDS-MSC凋亡，从而降低细胞内ROS水平，并进一步导致HIF-1水平下降以及IL-6、IL-8、TGFβ、VEGF四种细胞因子水平下降。
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