摘要
研究背景与目的 胃癌是全球范围内较为常见的恶性肿瘤，发病率位居第五位，是癌症相关死亡的第三大原因。尽管在过去数十年中，随着幽门螺杆菌的根除和卫生条件的提高，胃癌的总体发病率在全球范围内呈稳步下降的趋势。但是在我国、日本等东亚、东欧和南美等部分地区，胃癌仍是较为高发的恶性肿瘤，是重要的卫生经济负担。因此深入了解胃癌分子层面的发病机制对于早期诊断和更好地治疗胃癌具有重要的指导意义。 插头框转录因子(Forkhead Box，FOX)是一大类具有独特叉头状结构域且在进化上较为保守的超家族。目前已被发现的插头框转录因子家族可分为19个亚类共计49个。这些转录因子在胚胎发育、器官分化、免疫功能和新陈代谢等方面发挥着重要作用。近年来，人们逐渐关注到FOX家族也参与肿瘤发生发展的过程中。如FOXM1在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌和前列腺癌等多种肿瘤中发挥着促癌基因的作用，它可以促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、维持肿瘤干细胞的干性和介导肿瘤耐药等。FOX转录因子家族在胃癌中的作用也有部分报道，如FOXA1、FOXK1和FOXS1在胃癌中可能发挥着促癌基因的作用，导致肿瘤的进展和转移。而FOXJ1和FOXI1在胃癌中可能发挥着抑癌基因的作用，其低表达与不良预后相关。但目前对FOX转录因子在胃癌中的表达和作用尚缺乏系统全面的评价以及FOX转录因子在东西方胃癌人群中是否发挥着不同的作用尚不清楚。为此我们基于生物信息学的方法在两个大型的胃癌队列中(自东方人群ACRG队列和西方人群TCGA队列)分析了FOX在胃癌中的差异表达情况，以及其表达水平与病理临床特征之间的关系和对预后的影响，在TCGA队列中还探索了FOX的突变和基因组改变情况，分析了FOX的表达水平高低与肿瘤浸润免疫细胞丰度之间的关系，最后利用加权基因共表达网络分析法(WGCNA)构建了东西方人群的胃癌共表达调控网络，鉴定了与肿瘤发生相关的模块，以及对应模块潜在的生物学功能。根据前期研究结果选择FOXC1作为进一步研究对象，验证了其在胃癌中的表达情况，结合生物信息学和分子生物学的方法研究了FOXC1在胃癌中的功能和作用。 研究方法 从基因表达数据仓库(GEO)和基因组数据共享平台(GDC)中下载ACRG队列和TCGA队列的芯片数据和RNA-seq数据，并对数据进行了初步处理。利用limma和DESeq2软件包进行标准的差异化分析流程，以|logFC|>1且adjustedP<0.05(以BenjaminiandHochberg方法调整后值)为标准筛选差异基因，用文氏图筛选共同的差异FOX转录因子，统计分析了FOX表达高低与患者临床特征的关系，采用学生t检验或者Willcoxon秩和检验比较两组数据间均值的差异，采用方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis非参数方法比较多组变量间的均值差异(2组以上)。 利用Kaplan-Meier法和log-rank检验分析FOX表达高低对预后的影响，通过单因素Cox比例风险回归模型进一步量化风险大小，利用多因素Cox回归模型、前向和后向选择相结合的方法筛选有预后意义的FOX基因，纳入模型构建以FOX表达水平为基础的胃癌预后危险分数的公式。用散点图展示危险分数与生存时间的分布关系；用学生t检验或者Willcoxon秩和检验比较FOX在高、低危险组中的表达；用Kaplan-Meier法检验危险分数对预后的影响。 从cBioPortal下载胃癌拷贝数变异和突变数据，统计FOX基因的突变、扩增、融合和缺失等频率和分布，通过瀑布图展示FOX家族在胃癌基因组中的整体变化。 利用文献报道的24种肿瘤浸润免疫细胞的特征性基因，通过单样本基因富集的方法计算两个队列中每个胃癌样本的各种免疫细胞的特征性富集分数，通过斯皮尔曼等级相关系数衡量FOX表达与肿瘤浸润免疫细胞丰度之间的关系。 利用基因间的共表达程度作为量度，通过层次聚类等方法识别模式一致的相应模块，将模块与外部特征信息相关联，寻找生物学上有意义的模块，分别构建东西方胃癌队列的加权基因共表达网络，将感兴趣的模块进行基因富集分析以揭示其潜在的生物学功能和意义。 利用荧光定量PCR和免疫印迹的方法检测新鲜冰冻胃癌组织和胃癌细胞株中FOXC1的表达，在公共数据库Oncomine和TheHumanProteinAtlas中进一步佐证FOXC1的表达。通过共表达分析和基因集富集分析相结合的方法预测FOXC1在胃癌中潜在的生物学功能。利用MTS实验检测FOXC1敲减对胃癌细胞增殖的影响，利用流式细胞仪检测FOXC1敲减对胃癌细胞周期和凋亡的影响，利用平板克隆实验检测FOXC1稳定敲除对细胞克隆形成能力的影响，利用裸鼠体内皮下移植瘤实验检测FOXC1敲除对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。 研究结果 1.本研究共纳入300个病人的ACRG队列和363个病人的TCGA队列。通过差异分析流程，在ACRG队列中共有1545个差异基因，包括两个表达升高的FOX转录因子(FOXC1和FOXM1)和3个表达下降的转录因子(FOXF1、FOXF2和FOXP2)，在配对样本中我们也发现了同样的趋势。在TCGA队列中，共筛选出了4374个差异表达基因，包括16个在肿瘤中上调的FOX基因(FOXC1、FOXD1、FOXD2、FOXD4、FOXD4L1、FOXD4L4、FOXP3、FOXE3、FOXH1、FOXI3、FOXJ1、FOXL1、FOXL2、FOXM1、FOXN4和FOXS1)，7个下调的FOX基因(FOXD3、FOXF2、FOXP2、FOXE1、FOXF1、FOXI2和FOXN1)。 2.在ACRG队列中，高表达FOXC1和FOXM1与老年胃癌病人相关；FOXF1的高表达和女性胃癌患者相关，高表达FOXM1与男性胃癌患者相关；FOXC1和FOXM1的高表达与肠型胃癌相关，FOXF1、FOXF2和FOXP2的高表达和弥散型胃癌相关；幽门螺杆菌的感染和EB病毒感染与FOX表达高低未见统计学差异；FOXF2高表达与原发灶进展期相关；FOXF1和FOXF2高表达与淋巴结转移N分期相关；FOXF1和FOXF2高表达的与M1分期相关；FOXF1，FOXF2和FOXP2的高表达与胃癌进展期密切相关；FOXM1低表达和FOXF1、FOXF2、FOXP2的高表达与胃癌的复发密切相关。在TCGA队列中，高表达FOXD2，FOXE3，FOXM1与老年胃癌患者相关；而高表达FOXD3、FOXE1、FOXF2、FOXI2和FOXN4与胃癌患者年龄较小相关；FOXD3和FOXI2的高表达与胃癌的中、低分化相关；FOXD3、FOXF1、FOXF2、FOXL1、FOXP2、FOXS1的高表达和FOXH1、FOXN1的低表达与胃癌原发灶较高的分期有关；FOXD2和FOXE3的低表达与M1分期相关；FOXP2、FOXP3和FOXS1的高表达与肿瘤进展期相关；未发现FOX基因表达与患者性别和淋巴结转移N分期存在统计学相关。 3.在ACRG队列中，FOXC1、FOXF1、FOXF2、FOXP2高表达和FOXM1低表达与较差的总生存率和无病生存率密切相关，单因素Cox回归模型发现III期(StageIII)、IV期(StageIV)、FOXC1(高表达)、FOXF1(高表达)、FOXF2(高表达)、FOXP2(高表达)和FOXM1(低表达)是总生存率和无病生存率的危险性因素。利用多因素Cox回归模型筛选了有预后意义的变量并构建了危险评分模型：危险分数=0.128*FOXC1表达+0.160*FOXF2表达+0.174*FOXP2表达。生存曲线表明高危险分数组的患者总体生存率和无病生存率比低危险分数组低。在TCGA队列中，FOXF1、FOXL2、FOXN4、FOXP2、FOXS1高表达和FOXD2、FOXD4、FOXD4L1低表达与患者不良的总体生存率和胃癌特异性生存率相关。单因素Cox回归模型发现IV期(StageIV)、FOXD3(高表达)、FOXF1(高表达)、FOXL2(高表达)、FOXN4(高表达)、FOXP2(高表达)、FOXS1(高表达)和FOXD2(低表达)、FOXD4(低表达)、FOXD4L1(低表达)是总生存率和胃癌特异性生存率的危险性因素，利用多因素Cox回归模型筛选了有预后意义的变量并构建了以FOX转录因子为基础的危险评分模型：危险分数=-0.66*FOXD4表达+0.85*FOXF2表达+1.42*FOXI3表达+1.12*FOXP2表达+1.21*FOXS1表达，生存曲线表明危险分数较高的患者预后较差。 4.TCGA队列中FOXP2(6%)、FOXH1(5%)、FOXM1(5%)、FOXD4(5%)核苷酸拷贝数改变和突变频率最高，其中FOXP2基因以拷贝数扩增为主，而FOXH1以基因突变为主。 5.在ACRG队列中，FOXS1、FOXP3、FOXP2、FOXN3、FOXF1、FOXF2的高表达和FOXP4、FOXM1、FOXJ1的低表达与高丰度的肿瘤浸润免疫细胞成正比。在TCGA队列中，FOXS1、FOXP3、FOXP2、FOXI2、FOXN3、FOXF1、FOXF2的高表达和FOXM1、FOXJ1、FOXP4的低表达与高丰度的肿瘤浸润免疫细胞成正比。 6.通过构建ACRG胃癌共表达网络发现绿松石色模块，品红模块，红色模块，紫色模块，黑色模块，棕黄色模块，黄色模块与胃癌发生相关。免疫相关基因，细胞黏附、代谢相关基因，DNA复制和细胞分裂等生物学模块富集在上述模块中。通过构建TCGA胃癌共表达网络发现绿松石色模块，青色模块、棕色模块、品红模块、紫色模块、黄色模块、粉色模块在肿瘤发生中发挥了一定作用。免疫相关基因、能量代谢相关基因、新陈代谢，细胞外基质和细胞增殖等模块富集在西方人群的胃癌发生过程中。 7.荧光实时定量PCR和免疫印迹实验表明FOXC1在新鲜冰冻胃癌组织和胃癌细胞株中无论是mRNA水平还是蛋白水平表达均升高。基因共表达分析和基因集富集分析均提示FOXC1可能参与胃癌细胞周期、增殖、DNA损伤和细胞分裂等生物学过程，细胞功能学实验表明FOXC1敲低显著抑制了胃癌细胞增殖，诱导细胞G1期阻滞和细胞凋亡，抑制了胃癌细胞的克隆形成能力，抑制了胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。 结论 1.在ACRG和TCGA队列中，FOXC1，FOXM1在肿瘤中表达升高，而FOXF1，FOXF2，FOXP2表达降低。 2.FOXP2，FOXF1高表达在两个队列中均是预后不良的预测指标。 3.TCGA队列中FOXP2、FOXH1、FOXM1和FOXD4的核苷酸拷贝数改变和突变频率最高。 4.转录因子FOXS1，FOXP3，FOXP2，FOXN3，FOXF1，FOXF2的高表达和FOXM1、FOXJ1、FOXP4的低表达与高丰度的肿瘤浸润免疫细胞成正相关关系。 5.加权基因共表达胃癌网络表明两个队列肿瘤相关模块基因大致相同，ACRG中存在独特的细胞应激相关基因模块，而TCGA中存在能量代谢相关模块。 6.结合生物信息学方法和分子生物学功能实验证明FOXC1在胃癌中可以促进胃癌细胞的增殖。
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