摘要
研究目的： 建立COPD大鼠模型，设置空白对照组、模型对照组、泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组、化痰方组，在用药治疗结束后检测大鼠肺功能，观察肺组织病理变化和MMP-9的表达水平，检测BALF中TNF-α、IL-1和IL-6的含量，检测肺组织PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKKα、p-IKKα、NF-κB、p-NF-κB、PI3KmRNA、AKTmRNA、IKKαmRNA、NF-κBmRNA的相对表达量。根据上述结果探讨PI3K/AKT/IKKα/NF-κB信号通路与COPD发病的联系，观察益气方、活血方、化痰方及益气活血化痰方在本病中对该信号通路的影响以及它们在治疗效果上的异同进而分析它们在治疗COPD上的作用机制。 研究方法： 以气管滴入LPS溶液合并香烟烟雾暴露的造模方法建立COPD大鼠模型。在用药治疗结束后，检测各组大鼠肺功能，取材后以HE染色法观察肺组织病理变化，IHC法测定肺组织MMP-9的光密度平均值，ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1、IL-6的含量，WB法测定肺组织PI3Kp85α(Tyr607)(以下简称PI3K)、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKKα、p-IKKα、NF-κBp65(以下简称NF-κB)、p-NF-κBp65(以下简称p-NF-κB)的相对表达量，RT-QPCR法测定PI3KmRNA、AKTmRNA、IKKαmRNA、NF-κBmRNA的相对表达量。 研究结果： 1.肺组织HE染色病理切片观察分析 空白对照组：肺泡结构清晰，呈现规则连续网格状结构，肺泡结构囊存在；局部可见小支气管管壁，结构完整，细支气管切面呈扁圆状，内有柱状内皮细胞，腔大，局部可见管腔内壁的小静脉血管伴行，中充红细胞，未见炎症反应及组织损伤，符合正常肺组织切片的形态。模型对照组：细支气管切面呈扁圆状，柱状内皮细胞减少，管腔内壁明显增厚，细胞核少且着色较浅；肺泡结构模糊、形态不规则，部分有皱缩，细胞核数量较多、着色深，组织损伤和炎症的表现明显。泼尼松组、益气方组、活血方组的表现与模型组相似，但组织损伤及炎症反应相对较轻。益气活血化痰方组和化痰方组的病理变化改善更为显著，肺泡和细小支气管的形态大致与空白对照组相同，稍有组织损伤、但不明显，无明显的炎症反应表现。总体上看，病理变化的改善程度为：益气活血化痰方组≈化痰方组＞益气方组＞活血方组≈泼尼松组＞模型对照组。 2.肺功能 (1)用力肺活量(FVC) 模型对照组的FVC与空白对照组相比显著(“显著”指差异具有统计学意义，α=0.05，下同)下降，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的FVC有显著的上升(P＜0.05)，而益气方组和活血方组的FVC有一定的升高趋势，但其差异不具有统计学意义。 (2)0.3秒用力呼气量与用力肺活量的比值(FEV0.3/FVC) 模型对照组的FEV0.3/FVC与空白对照组相比显著下降，P＜0.01；与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的FEV0.3/FVC有显著的上升，P＜0.05；益气方组和活血方组的FEV0.3/FVC与模型对照组相比，差异均不具有统计学意义；与益气方组和活血方组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的FEV0.3/FVC均显著上升，P＜0.05；与活血方组相比，益气方组的FEV0.3/FVC有显著的上升(P＜0.01)。 (3)呼气流量峰值(PEF) 模型对照组的PEF与空白对照组相比显著下降，P＜0.01；与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的PEF有显著的上升，P＜0.05；益气方组和活血方组的PEF与模型对照组的差异均不具有统计学意义；与益气方组和活血方组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的PEF均显著上升，P＜0.05。 总体上看，模型对照组与空白对照组相比肺功能显著下降，再结合肺组织HE染色病理切片的结果，表明本次造模是比较成功的。泼尼松组、益气活血化痰方组和化痰方组的肺功能有显著改善，益气方组和活血方组的肺功能有一定的改善趋势，但与模型对照组相比，差异不具有统计学意义。 3.肺组织MMP-9的光密度平均值 模型对照组的光密度平均值与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、活血方组和化痰方组的光密度平均值有显著的下降，P＜0.05。与泼尼松组、益气活血化痰方组和益气方组相比，活血方组和化痰方组的光密度平均值均有显著的下降(P＜0.05)，而益气方组的光密度平均值与上述三组相比则显著升高，P＜0.05。 4.ELISA测定BALF中TNF-α、IL-1、IL-6的含量 (1)TNF-α 模型对照组的TNF-α含量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的TNF-α含量有显著的下降，P＜0.05。泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组之间的两两比较不具有统计学意义，但益气活血化痰方组和化痰方组与其他三个组相比，TNF-α含量有下降的趋势。 (2)IL-1 模型对照组的IL-1含量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的IL-1含量有显著的下降，P＜0.05。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IL-1含量有显著的下降，P＜0.05。与活血方组相比，化痰方组的IL-1含量有显著的下降，P＜0.01。与益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IL-1含量均有下降的趋势，但不具有统计学意义。 (3)IL-6 模型对照组的IL-6含量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的IL-6含量有显著的下降，P＜0.05。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IL-6含量有显著的下降，P＜0.05。与活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IL-6含量均有显著的下降，P＜0.01。与益气方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IL-6含量有下降的趋势，但不具有统计学意义。 5.肺组织PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKKα、p-IKKα、NF-κB和p-NF-κB的相对表达量 (1)PI3K和p-PI3K 模型对照组的PI3K相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气活血化痰方组相比，化痰组的PI3K相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与益气方组相比，化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.01。与活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。 模型对照组的p-PI3K相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的p-PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的p-PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气活血化痰方组相比，化痰方组的p-PI3K相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与益气方组相比，益气活血化痰方组的p-PI3K相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与益气方组和活血方组相比，化痰方组的p-PI3K相对表达量显著下降，P＜0.01。与活血方组相比，益气活血化痰方组的p-PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。 (2)AKT和p-AKT 模型对照组的AKT相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的AKT相对表达量显著下降，P＜0.01。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的AKT相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气方组和活血方组相比，化痰组的AKT相对表达量显著下降，P＜0.01。与活血方组相比，益气活血化痰方组的AKT相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气方组相比，益气活血化痰方组的AKT相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 模型对照组的p-AKT相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的p-AKT相对表达量显著下降，P＜0.01。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的p-AKT相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰组的p-AKT相对表达量均显著下降，P＜0.05。与益气活血化痰方组相比，化痰方组的p-AKT相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 (3)IKKα和p-IKKα 模型对照组的IKKα相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IKKα相对表达量显著下降，P＜0.01，而益气方组和活血方组的IKKα相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的IKKα相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IKKα相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IKKα相对表达量显著下降，P＜0.05。 模型对照组的p-IKKα相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，化痰方组的p-IKKα相对表达量显著下降，P＜0.01，而益气活血化痰方组、益气方组的p-IKKα相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与泼尼松组相比，化痰方组的p-IKKα相对表达量显著下降，P＜0.05，而益气活血化痰方组、益气方组的p-IKKα相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的p-IKKα相对表达量显著下降，P＜0.05。 (4)NF-κB、p-NF-κB 模型对照组的NF-κB相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的NF-κB相对表达量显著下降，P＜0.01。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的NF-κB相对表达量显著下降，P＜0.01。与益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰组的NF-κB相对表达量均有显著下降，P＜0.05。 模型对照组的p-NF-κB相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的p-NF-κB相对表达量显著下降，P＜0.01。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的p-NF-κB相对表达量显著下降，P＜0.01。与益气方组和活血方组相比，化痰组的p-NF-κB相对表达量显著下降，P＜0.05，而益气活血化痰方组的p-NF-κB相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 6.肺组织PI3KmRNA、AKTmRNA、IKKαmRNA、NF-κBmRNA的相对表达量 (1)PI3KmRNA 模型对照组的PI3KmRNA相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的PI3KmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05，而活血方组的PI3KmRNA相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05，而益气方组、活血方组和化痰方组的PI3KmRNA相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与益气方组相比，益气活血化痰方组和化痰组的PI3KmRNA相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的PI3K相对表达量显著下降，P＜0.05。 (2)AKTmRNA 模型对照组的AKTmRNA相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组的AKTmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05，而益气方组、活血方组和化痰方组的AKTmRNA相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与泼尼松组、益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的AKTmRNA相对表达量均有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 (3)IKKαmRNA 模型对照组的IKKαmRNA相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，益气活血化痰方组、益气方组和化痰方组的IKKαmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05。与泼尼松组、益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的IKKαmRNA相对表达量均有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 (4)NF-κBmRNA 模型对照组的NF-κBmRNA相对表达量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。与模型对照组相比，泼尼松组、益气活血化痰方组、益气方组、活血方组和化痰方组的NF-κBmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05。与泼尼松组相比，益气活血化痰方组和化痰方组的NF-κBmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05，而益气方组和活血方组的NF-κBmRNA相对表达量均有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。与益气方组和活血方组相比，益气活血化痰方组的NF-κBmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05。与益气方组相比，化痰组的NF-κBmRNA相对表达量显著下降，P＜0.05。与活血方组相比，化痰组的NF-κBmRNA相对表达量有下降的趋势，但是差异不具有统计学意义。 研究结论： (1)由LPS和香烟烟雾暴露导致的COPD存在PI3K/AKT/IKKα/NF-κB信号通路的表达上调和活化，这可能是其肺部炎症反应产生和病理改变的重要原因。 (2)传统中医理论所说的“肺气虚”、“肺血瘀”和“痰浊蕴肺”可能与现代医学所描述和定义的肺部炎症有关联。与益气方和活血方比较，化痰方对肺部炎症和气道重构的治疗效果更好。 (3)益气方、活血方、化痰方及益气活血化痰方均可以不同程度地改善这类COPD大鼠的肺功能，减轻肺组织病理改变以及降低肺组织MMP-9、TNF-α、IL-1和IL-6的含量，上述作用可能是通过抑制PI3K/AKT/IKKα/NF-κB信号通路的转录、表达和活化而产生的。 (4)在治疗这类COPD时，益气活血化痰方和化痰方的疗效相似，并且优于益气方、活血方和中小剂量的泼尼松。
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