摘要
在干旱、盐碱地区园林绿化植物仍比较缺乏，抗逆植物基因工程育种是丰富多逆境环境条件下绿化植物的有效快捷途径之一，其中抗多种非生物胁迫的功能基因的筛选尤为重要。黄耆(Astragalus membranaceus)是抗逆性较强的观赏和药用植物资源，在寒冷、干旱和盐碱地区具有广泛的开发应用前景，也是非常好的抗逆基因资源植物。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)在绿色植物中广泛存在，作为苯丙烷次生代谢和初级代谢的桥梁，通常对植物的生理代谢和逆境胁迫应答有重要作用。本研究对克隆到的黄耆AmPAL基因进行了多逆境条件下的表达特性分析、亚细胞定位及转AmPAL烟草后代表达稳定性检验、对烟草形态发育的影响;并进行了多种非生物胁迫下的抗逆功能解析;通过对同源性较高的烟草NtPAL1蛋白互作网络构建进一步探讨了转AmPAL烟草的抗逆机理;同时开展了AmPAL基因在观赏花卉百合和矮牵牛中的异源转化，以期提高花卉的抗逆性。本研究成果可为今后开展花卉抗逆基因工程育种提供基因资源，也为黄耆抗逆机理深入研究及开发利用奠定了理论研究基础。主要研究结果如下: 1.通过RT-PCR技术获得黄耆的PAL基因(AmPAL,EF567076)的全长cDNA序列，该基因具有Lyase_aromatic结构域，属于phenylalanine ammol/Lonia-lyase家族。NJ法系统进化树分析发现黄耆的PAL与同科的大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）和苜蓿（Medicago sati）聚到一起，相似度分别为89.18％、87.59％和57.36％。 2.黄耆AmPAL是响应盐、碱、干旱胁迫的功能基因并响应ABA信号诱导，主要在根中响应胁迫并高表达。在根和叶中AmPAL显著地受盐(NaCl)、碱(NaHCO3)、PEG6000和ABA胁迫诱导表达而显著增加。尤其在根中，NaCl胁迫对AmPAL基因的诱导表达6h后增加了9.5931倍;NaHCO3胁迫48h后根AmPAL基因表达量增加了24.5243倍。在叶中PEG6000胁迫对AmPAL基因的诱导表达显著，48h胁迫表达持续增加，根中是先增加后减少的表达水平变化，且都高于对照;ABA信号诱导24h时在叶中表达出现高峰，根中的诱导表达量也是增加的趋势。 3.构建表达载体pBI121-AmPAL-GFP,应用基因枪法将其转入洋葱表皮细胞中，检测AmPAL-GFP融合蛋白的绿色荧光，表明AmPAL亚细胞定位于细胞膜上。 4.构建植物表达载体pCXSN-AmPAL，并遗传转化烟草，经Southern杂交、Northern杂交检测到35S驱动AmPAL在T3代烟草中以单拷贝形式超表达。 5.AmPAL基因在逆境胁迫下产生了生理上的系列抗性响应，通过减轻逆境胁迫下膜脂氧化损伤及提高光合效率增强植物抗性，来增强植物抗性，表现出抗性生长。对转AmPAL基因烟草T3代株系抗逆胁迫相关性研究表明:转AmPAL基因烟草2叶龄幼苗在NaCl胁迫下叶片和根生长都受到抑制，但根长生长量、鲜重、PAL酶活性优于野生型(WT);转基因株系Na+/K+显著高于W T的，提高了K+的利用率，表现出胁迫下的生长优势。在引起栽培基质pH值变化的NaHCO3胁迫下，转AmPAL基因烟草根比WT的有较好的生长势，而MDA较低;转基因烟草5叶龄幼苗在盐碱、干旱处理下，随着处理浓度增加烟草植株生长均受到抑制，但是过表达AmPAL烟草表现出生长优势。同一浓度处理下，检测到过表达AmPAL烟草幼苗的SOD活性、脯氨酸含量、叶绿素含量及叶绿素荧光参数优于WT。 6.AmPAL可能通过某种途径参与了植物的生长发育。通过对过表达AmPAL T3代烟草的生长发育进行观测发现植株变矮、节间距缩短、地径变大、叶片变宽、叶长/叶宽的比例变小等特点，始花期推迟52天，花朵数量有所增加，连续花期延长4天。 7.通过NCBI BLAST比对发现AmPAL与烟草NtPAL1同源性最高。NtPAL1基因启动子序列含有大量逆境相关的响应元件及光响应元件，在逆境条件下，这些逆境响应元件会启动NtPALI基因的表达;NtPAL1蛋白互作网络分析发现10个互作蛋白，其中XP_009622435.1、XP_009612485.1、XP_009631403.1、XP_009631897.1、XP_009609722.1和XP_009607087.1参与苯丙氨酸代谢途径，XP_009612485.1和XP_009631403.1参与甜菜碱的生物合成，XP_009622435.1、XP_009631897.1、XP_009612485.1和XP_009631403.1是维生素B6的基本类型和表现形式，这些产物都与植物抗逆性有关，而转AmPAL基因烟草PAL过表达，进一步促进了这些物质的合成，进而提高了植物的抗逆性。进一步说明AmPAL是提高植物抗逆功能的关键基因。 8.构建的pCXSN-AmPAL植物表达载体，通过农杆菌介导法将AmPAL基因分别转入观赏花卉矮牵牛和细叶百合内，通过抗性筛选和抗性植株PCR检测，证明目的基因已成功插入到了矮牵牛和细叶百合的基因组。荧光定量PCR检测到目的基因AmPAL在转基因细叶百合中的过表达。 综上，AmPAL基因具有抗逆功能;在逆境胁迫下，AmPAL基因抗逆性与膜脂抗氧化性存在互作关系;AmPAL基因对烟草营养生长和生殖生长都产生了影响。
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