摘要
海洋微生物天然产物是创新药物的重要来源。海洋放线菌通常生存在低温、低氧、高压、高盐等极端环境中，产生了大量独特的天然活性次级代谢产物以应对潜在的环境胁迫。其中，环肽化合物是主要的海洋放线菌次级代谢产物之一，因其新颖的结构特征和良好的生物活性在医药等领域有着广泛的应用价值。Atratumycin是分离于海洋放线菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的一个基因工程菌株—Streptomyces atratus SCSIO ZH16NS-80S的环肽化合物，它具有良好的体外抗结核分枝杆菌活性。本论文以环肽化合物atratumycin为研究对象，综合利用生物信息学、分子生物学和天然产物化学等手段对其开展生物合成以及组合生物合成研究。目前已取得了以下研究成果: 1.鉴定了atratumycin生物合成基因簇 对S.atratus SCSIO ZH16NS-80S菌株的基因组序列进行生物信息学分析，发现atratumycin生物合成基因簇由33个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)组成，全长约62.7kb，其中主要包括三个连续的非核糖体肽合成酶（NRPS）编码基因、十个肉桂酰基合成基因、一个NRPS装配前修饰基因、三个调控基因以及两个转运基因等。通过构建NRPS骨架合成基因突变株Δatr23，确定了负责atratumycin生物合成的基因簇。 2.解析了atratumycin生物合成途径 在前期构建的S.atratus SCSIO ZH16NS-80S菌株的遗传操作体系上，利用PCR-targeting技术对atratumycin基因簇中的各基因进行了插入失活，共构建基因失活突变株33个。通过构建突变株确定了一个NRPS装配前修饰酶细胞色素P450(atr27)负责L-苯丙氨酸的β-羟基化。综合生物信息学分析和基因失活实验，解析了atratumycin的环肽骨架及其肉桂酰基结构单元的生物合成途径。 3.鉴定了atratumycin生物合成中调控和转运基因功能 利用基因的插入失活、回补及过表达实验鉴定了两个LuxR家族正调控基因atr1和atr2，两个ABC转运蛋白基因atr29和atr30以及一个特殊的SARP家族负调控基因atr2在atratumycin生物合成中的调控作用和转运机制;利用上述调控和转运机理构建了5株高产菌株，使atratumycin的产量较野生型提高1.7-2.3倍;通过三亲本接合转移技术实现了具有较大生物合成基因簇的atratumycin在模式菌株Streptomyces coelicolor M1154的异源表达。 4.利用组合生物合成技术合成了新颖含肉桂酰基环肽化合物 通过将atrovimycin生物合成基因簇中的avm4至avm29基因片段导入atratumycin的生产菌株S.atratus ZH16NS-80S，构建了组合生物合成工程菌株Streptomyce atratus SCSIO ZH16NSH。该工程菌株可以生产具有不同长度的2-烯（烷）基肉桂酰基侧链的新化合物atratumycin B和atratumycin C。生物活性测试显示化合物atratumycin B对Mycobacterium tuberculosis H37Rv具有良好的抗菌活性。 综上所述，本课题首次鉴定了抗结核环肽化合物atratumycin的生物合成基因簇;基于生物信息学分析和PCR-targeting等方法解析了atratumycin的生物合成途径和调控转运机制;利用代谢工程构建了atratumycin的高产菌株并通过三亲本接合转移技术实现了atratumycin基因簇在Streptomyces coelicolor M1154中的异源表达;利用组合生物合成获得了新抗结核环肽化合物atratumycin B和atratumycin C，丰富了含肉桂酰基环肽化合物库，为后续研究肉桂酰基与抗结核活性的构效关系奠定基础。
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