摘要
种间杂交子代不育（hybrid sterility,HS）是合子后生殖隔离的重要机制，有助于新物种的形成。动植物中广泛存在的杂交不育长期困扰着进化生物学家，直到Dobzhansky-Muller杂交不亲和模型以及Haldane法则的提出，为该问题的解决提供了思路。目前，因为方法和工具导致限制，对于研究种间杂交不育的机理认识依旧不够深入。青藏高原农牧民对于牦牛和黄牛杂交优势的利用有悠久的历史，但因为杂交后代犏牛雄性不育导致杂交优良性状无法固定。牦牛和黄牛有共同的祖先以及相同的染色体数目，因此犏牛可以作为研究物种进化以及生殖隔离机制的理想模型。近20年，对于犏牛雄性不育的机制研究不断增加，但对于该问题的根本解决还需要更多的数据支持。基于前提基础，本研究的科学问题是:犏牛精子发生缺陷和减数分裂异常的原因是什么？ 为了解答上述科学问题，本研究以雄性牦牛、犏牛为研究对象，首先通过组织形态学以及免疫组织化学检测牦牛3月龄、5月龄、8月龄和24月龄四个不同发育时期，以明确正常精子发生过程，以此为参考，随后分析了犏牛睾丸生殖细胞的发育过程，并通过转录组测序对不同时期基因表达动态变化进行分析，确定牦牛精子发生过程中必需的基因以及通路。以此为基础，随后分别对精母细胞减数分裂重组进程了详细分析，确定犏牛精子发生缺陷的关键因素，并结合回交一代的生殖细胞发育表型以及转录组数据验证了缺陷基因表达的恢复。论文最后针对犏牛精原细胞分化的缺陷的原因进行分析。从减数分裂和精原细胞分化两个表型入手，论文得出以下结论: 1)运用组织形态学以及免疫组织化学方法检测牦牛3月龄、5月龄、8月龄和24月龄四个不同发育时期以及犏牛3月龄和12月龄睾丸生殖细胞的发育过程，并结合转录组测序对牦牛和犏牛睾丸不同发育时期基因表达动态变化进行分析。结果显示，3月龄性原细胞时期向5月龄精原细胞时期过渡转变时与普通牛相似，不存在发育延迟现象。而犏牛睾丸从3月到12月龄与牦牛3月到5月相似，12月龄曲细精管只有支持细胞、精原细胞和极少量的精母细胞，整体发育较牦牛晚。牦牛在8月龄出现大量的精母细胞以及圆形精子。24月龄，牦牛精子变形完成，转变为长形精子，可以完成精子发生整个过程。牦牛性原细胞向精原细胞转变过程中有11904个差异显著的转录本，精原细胞向精母细胞发育过程中有4381个差异显著转录本，精母细胞到精子发育过程中仅有2459个差异显著的转录本。犏牛3月龄睾丸相较于12月龄有6606个差异转录本。对受体基因进行分析筛选发现，CXCR4在牦牛精原细胞时期以及犏牛12月龄均高表达，其编码蛋白在牦牛性原细胞和小部分精原细胞中定位。 2)犏牛形态学和转录组均显示减数分裂异常，为了进一步明确减数分裂异常的原因，我们利用免疫组织荧光、减数分裂铺片和比较转录组检测分析犏牛和回交一代减数分裂重组事件。结果显示，正交反交犏牛精子发生均阻断在减数分裂。犏牛睾丸凋亡细胞相较于牦牛显著增多而细胞增殖比例减少。减数分裂进程分析显示犏牛精母细胞在粗线期染色体完全联会，并且可以完成减数第一次分裂进入分裂中期。重组分析结果显示，犏牛精母细胞在细线期减数分裂重组正常启动，DSB在偶线期开始正常修复;在粗线期精母细胞中无性小体形成，γH2Ax在常染色体滞留。同时，粗线期精母细胞MLH1位点在犏牛中也显著减少。转录组数据显示，相较于牦牛，犏牛睾丸中大量的减数分裂基因以及DSB修复相关基因在犏牛中显著下调。相反，而大量的X-linked基因在犏牛中显著上调。 3)通过回交一代形态学分析，发现3种表型YCspg、YCspc和YCspt，且生殖细胞数量逐渐增多，部分个体有精子形成，单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）检测表明产生的精子具有功能。减数分裂重组分析发现，DSB在粗线期滞留数量减少，细胞的性小体形成正常。比较犏牛、YCspc和YCspt转录组数据分析发现减数分裂基因、DSB修复相关基因表达量逐渐上升，而X-linked基因表达量逐步下降。对黄牛、牦牛、犏牛以及回交一代PRDM9测序分析表明，PRDM9基因型在犏牛中呈杂合状态，回交一代中具有杂合和纯合两种状态，因此推测PRDM9基因型与减数分裂缺陷不相关。 4)除减数分裂异常，我们通过免疫组化结果发现犏牛中部分精原细胞从曲细精管脱落。为明确原因，我们通过ELISA、qPCR以及细胞培养对犏牛精原细胞的分化进行研究。结果表明，犏牛中睾丸维甲酸显著低于牦牛，定量分析显示CYP26B1生犏牛中高表达，RA代谢通路也受到影响。形态学检测到犏牛睾丸细线期精母细胞提前凝集。对培养牦牛犏牛精原细胞进行RA处理，结果显示牦牛精原细胞分化基因高表达，而犏牛精原细胞中RA应答基因无显著变化。推测犏牛精原细胞不能及时响应RA信号，导致分化异常。 综上所述，本研究以牦牛不同时期睾丸生殖细胞的发育形态学以及基因动态表达为基础，利用免疫荧光、减数分裂铺片以及转录组学多种手段全面分析了犏牛生殖细胞发育阻断的原因，首次发现犏牛γH2Ax滞留，DSB不能及时修复是导致精母细胞减少的关键因素。同时证实了睾丸中RA的不足以及RA代谢通路失调，体外培养犏牛精原细胞不能应答维甲酸信号，这可能是犏牛生精异常的另一原因。本研究为犏牛雄性不育后续研究提供了明确方向。
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