摘要
高粱因其高光合效率，高抗逆性，被认为是重要的能源作物，其茎秆和籽粒均可用作能源原料。了解调控茎秆和籽粒两大主要器官物质积累的遗传基础，可加速高粱遗传改良进程。液泡转化酶(vacuolar invertase，VIN)不可逆地将蔗糖水解为果糖和葡萄糖，调控库器官糖分积累、物质积累及器官大小。对高粱液泡转化酶的已有研究表明，在茎秆和籽粒发育早期，液泡转化酶基因表达水平高，酶活性高;而在发育后期液泡转化酶活性下降。据此推测，液泡转化酶可能在高粱茎秆和籽粒早期库器官建成过程中具有“扩库”的作用，调控茎秆和籽粒的大小;在茎秆后期糖分积累期，降低酶活性，具有“节流”的作用，可增加糖分含量。鉴于该基因家族对高粱性状调控可能的重要作用和研究的不足，开展了本研究。 高粱中只有两个液泡转化酶基因:SbVIN1(Sobic.004G004800)和Sb VIN2(Sobic.006G160700)。为了解两个基因对高粱性状的调控作用，我们对两个基因在高粱中的时空表达进行了分析。结果表明，Sb VIN在苗根中表达量最高，在成熟期节间表达量最低。Sb VIN2在叶中表达量最高，而在节间表达量极低。转录组数据表明，在茎秆伸长结束，糖分开始积累的抽穗期，两个基因在籽粒高粱Ji2731茎秆中的表达都高于甜高粱E-tian。两个Sb VIN基因表达模式存在差异，Sb VIN2在茎秆中表达量极低。 基于基因同源性来预测酶催化特点往往会导致错误结论，而明确酶催化特点是理解酶基因生理功能的基础，因此本研究利用毕赤酵母表达系统对两个Sb VIN基因进行异源表达后，开展了体外酶学特点的分析。结果表明两者都具有典型的酸性转化酶的酶学特点，最适pH为5，对蔗糖具有高亲和力，Km分别为49mM和45mM。但二者的最适温度和温度稳定性不同，其中，SbVIN1的最适温度为45℃，而SbVIN2为65℃。 在确定酶催化特点后，在拟南芥过表达两个Sb VIN基因并检测表型变化，查验其在体内是否具有生物学功能，为了解两个基因在高粱中的作用和未来的分子育种提供参考和指导。结果表明，分别过表达SbVIN1和Sb VIN2的转基因株系表型相似。与对照野生型相比，转基因拟南芥8叶期苗地上部分生物量增加，可溶性酸性转化酶活性上升，葡萄糖含量下降，而蔗糖含量没有显著差异;花期提前;种子百粒重在部分株系中下降。 通过上述实验，明确了两个高粱液泡转化酶的酶学特点和在植物体内的功能。为了进一步了解两个基因对高粱茎秆和籽粒性状的调控作用，对两个基因在群体中的序列变异进行了检测，通过候选基因关联分析方法分析了序列变异与性状间的相关性。关联分析结果发现，SbVIN1与茎秆性状茎长、茎粗、节数、杆重、锤度(brix)，与籽粒性状百粒重和粒宽显著关联。显著关联位点位于5'上游区域和内含子区，形成4个主要的单体型（haplotype）。对四种单体型之间的表型进行了差异显著性分析，发现不同单体型之间显著关联性状具有显著差异，佐证了关联分析的结果。其中，单体型1是可用于茎秆育种的优异单体型，而单体型4可用于未来籽粒育种。Sb VIN2与茎秆总糖含量和一年的粒宽有关联。显著关联位点集中于5'上游区，并形成2个主要的单体型。单体型1和2分别对应高的茎秆总糖含量和大粒表型。 综上所述，本实验证明高粱两个液泡转化酶基因都具有典型的液泡转化酶酶学特点。SbVIN1与高粱茎秆和籽粒很多性状具有显著关联。本研究不仅开发了可用于辅助育种的分子标记，也为未来进一步研究SbVIN基因对高粱茎秆性状、籽粒性状以及物质分配的调控机理打下了基础。
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