摘要
睾丸是由大量有序盘绕的曲细精管组成的雄性器官。曲细精管又称为生精小管，其中含有各类生殖细胞(Germ cell)和支持细胞(Sertoli cell)，生殖细胞包括精原干细胞，精母细胞，圆形精细胞以及长型精细胞。研究表明，生殖细胞最早起始于胚胎发育阶段。在小鼠体内，原始生殖细胞在胚胎期13.5天全部迁入生殖嵴，原始生殖细胞在生殖嵴中保持静息状态，待小鼠出生后，原始生殖细胞快速增殖，经过精原细胞的自我更新与分化，精母细胞的减数分裂和精子的塑形，最终完成精子发生过程。睾丸支持细胞呈现不规则的高椎体形，细胞基部附着在曲细精管基底膜上，项部向曲细精管管腔延伸，并且在支持细胞的四周存在着不同发育阶段的生殖细胞，越靠近曲细精管管腔的生殖细胞发育越成熟。青春期前的支持细胞处于还未成熟的状态，青春期后随着曲细精管管腔的出现，为成熟的支持细胞转变为成熟的支持细胞。未成熟的支持细胞具有比较强的吞噬能力，并且可以抑制精母细胞完成减数分裂过程。直到青春期，支持细胞的形态结构发生显著变化，促使睾酮转变为雌激素的芳香化酶减少，促卵泡激素不断增多，具有合成雌激素的结合蛋白运铁蛋白的能力，成熟的支持细胞不再有细胞分裂的能力。支持细胞通过自身伸出的突起来包围各类生殖细胞，进而对生殖细胞起着机械支持的作用。另外，支持细胞还可以对生殖细胞起到保护和营养供应的作用。曲细精管中没有血管，其底部可以从管腔外周的结缔组织中获取营养物质，但是这需要借助支持细胞的力量才可以顺利运输营养物质。在睾丸中，除了曲细精管中的生殖细胞和支持细胞，在曲细精管外还存在一种睾丸间质细胞(Leydig cell)。睾丸间质细胞成群分布在曲细精管之间，该类细胞整体呈现出圆形或者椭圆形，体积较大，直径约为20μm，细胞质呈现出嗜酸性，细胞核位于细胞中央，也是呈现圆形或者椭圆形。进入青春期后，睾丸间质细胞受垂体前叶嗜碱性细胞分泌的黄体生成素的作用，开始合成并且分泌雄性激素，主要是睾酮。男性分泌的睾酮可以促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和生殖功能。在睾丸中，睾酮主要在Leydig细胞中生成和分泌，它的缺失可导致原发性或迟发性性腺功能减退症，进而影响男性的正常生活。在大鼠Leydig细胞中，发现自噬相关蛋白水平较高，且其中大量的自噬体含有线粒体和光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，光面内质网可以促进雄激素生成的细胞器）。这提示我们在Leydig细胞中自噬有可能调控类固醇生成及激素分泌。研究结果表明，在大鼠中自噬水平与睾酮生成关系密切，自噬过程阻断会破坏睾丸代谢平衡。但是，自噬调控睾酮生成的机制尚待研究。 SIRT1是依赖于NAD+的SIRTs家族成员的重要蛋白之一，该蛋白与酵母中的Sir2高度相似。SIRT1通过去乙酰化修饰不同的底物参与到多种生理调控过程中，比如组蛋白修饰、细胞生存、代谢过程、线粒体呼吸链以及自噬等过程。 为了研究Sirt1在睾酮生成过程中的作用，我们构建了在Leydig细胞中特异敲除Sirt1(Sirt1F/F;SF1-cre)的小鼠。我们发现在对照组和敲除小鼠中，睾丸形态，附睾中的精子数量，精子活力以及形态等没有发生明显改变。为了进一步研究Sirt1的功能，我们检测了对照组和敲除组小鼠的交配率，发现敲除小鼠的交配率明显下降，且敲除组的雄鼠更为温顺。为了研究敲除组雄鼠交配率下降及变温顺的原因，我们进行了小鼠性行为的分析，发现与对照组小鼠相比，敲除组雄鼠对雌鼠的感兴趣的潜伏时间有所延长，而对雌鼠的爬趴持续时间缩短。有意思的是，敲除鼠对雌鼠的持续嗅闻时间并没有发生明显改变。总而言之，敲除组的性行为发生异常，与晚发性性腺功能减退症状高度相似。 在脊椎动物中，雄性性行为受到睾酮水平的调控，而睾酮由Leydig细胞分泌。因此，我们猜测血清中睾酮水平的变化是导致雄鼠性行为异常的原因，于是，下一步我们检测了血清中睾酮的水平，发现敲除组血清中睾酮水平发生明显下降。此外，我们还检测了Leydig细胞中的睾酮水平，发现敲除组的Leydig细胞中血清水平也明显下降。综合以上实验结果，我们认为在敲除鼠中由于睾酮水平的剧烈下降导致雄鼠性行为异常。 睾酮水平可受到体内外因素调控，而下丘脑-垂体-性腺轴，LH及FSH水平变化是体内调控睾酮水平的重要途径。因此我们下一步检测了对照组及敲除组血清的LH和FSH水平，发现与对照组相比，敲除组中的LH及FSH水平没有发生剧烈变化。这预示着敲除组中睾酮水平的变化不是由于LH和FSH水平变化引起的。 因为3β-HSD是睾酮生成过程中的重要3β-羟基类固醇脱氢酶，于是我们下一步在对照组和实验组Leydig细胞中对3β-HSD的mRNA水平和蛋白水平进行检测，发现在敲除组中，3β-HSD的mRNA水平和蛋白水平都出现明显下降。接下来我们利用免疫荧光方法，在敲除组睾丸切片中我们检测到了3β-HSD水平明显下降。为了进一步确认该结果，我们在Leydig细胞中检测了3β-HSD的酶活性，发现与对照组相比，敲除组中3β-HSD的酶活性明显降低。综述以上结果，SIRT1在Leydig细胞中缺失可导致胆固醇形成异常。 在Leydig细胞中，胆固醇是合成睾酮的主要原料，我们利用免疫荧光分析方法检测了BODIPY的信号来确定细胞质脂滴的含量，因为在细胞质中胆固醇主要以胆固醇酯的形式存在于脂滴内。令我们意外的是，在敲除组中，脂滴的含量明显下降。在油红染色中，我们也观察到了相似的结果，即脂滴含量明显下降。在分离的Leydig细胞中，我们进一步确定了睾酮含量下降的结果。甘油三酸酯与睾酮一样储存在脂滴内，于是我们下一步检测甘油三酸酯浓度在Leydig细胞中是否发生了变化。与睾酮一样，甘油三酸酯在敲除组的Leydig细胞以及血清中的水平也发生了明显下降，但是在睾丸提取液中的水平却没有明显变化。以上结果说明在敲除组中睾酮的缺失可能是由于Leydig细胞中胆固醇摄入不足导致的。 已有报道表明，SIRT1是重要的自噬调控蛋白，它可以直接乙酰化修饰自噬蛋白LC3和ATG7来调控它们从细胞核转移到细胞质中。在我们之前的实验结果中，发现自噬可以影响Leydig细胞中胆固醇的摄入量，进而参与到睾酮的生成过程当中。为了证明SIRT1是否可以通过调控自噬流而参与睾酮生成过程，我们接下来检测了自噬相关蛋白p62和LC3Ⅰ的蛋白含量，发现这两种蛋白在敲除组细胞中发生积累，表明在Leydig细胞中敲除Sirt1缺失会导致自噬流异常。LAMP2是重要的溶酶体膜整合蛋白，它可作为溶酶体的标记蛋白，在SIRT1缺失的Leydig细胞中，我们发现LAMP2的蛋白水平明显下降。因此敲除组中的自噬流异常可能和溶酶体相关。 Leydig细胞中SIRT1的缺失导致脂滴和胆固醇水平下降可能是由于细胞中胆固醇摄入不足造成的。在细胞睾酮合成过程中，高密度脂蛋白是胆固醇的主要来源。因此我们利用免疫荧光的方法检测了对照组和敲除组中高密度脂蛋白的信号，发现敲除组中高密度脂蛋白的荧光信号明显下降。因此Sirt1参与到了胆固醇的形成过程中。在胆固醇的摄取当中，SR-BI作为脂蛋白受体发挥重要作用。于是，我们在对照组和实验组中检测了SR-BI的含量，发现该蛋白受体在敲除组中国明显下降。因此，SIRT1缺失导致细胞中胆固醇摄取不足可能是由于SR-BI下调引起的。 为了证明SR-BI与自噬的关系，我们接下来在对照组和敲除组中检测了SR-BI的mRNA水平，意外地发现SR-BI的mRNA水平没有下降，这表明Sirt1可能是通过调控SR-BI的翻译后修饰来调控其蛋白水平的。SR-BI的负调控因子包括MAP17，NHERF1以及NHERF2，已报道这些负调控因子的累积可导致SR-BI的翻译后修饰变化，进而导致其蛋白水平下降。接下来，我们在对照组和敲除组中对这对负调控因子水平进行检测，发现在敲除组中NHERF2水平明显累积。因此，SIRT1的缺失可能导致NHERF2累积，进而引起SR-BI水平下调。 为了研究这些在敲除组中变化蛋白的关系，我们在对照组及敲除组中检测了SR-BI和NHERF2的蛋白水平，发现NHERF2与SR-BI蛋白确实呈负相关。已知NHERF2降解可受到自噬-溶酶体通路调控，因此在Leydig细胞中自噬过程可能调控NHERF2蛋白降解，进而影响SR-BI水平。为了证实这一想法，我们在敲除组中敲低了Nherf2基因，发现SR-BI水平有所增高。因此，SIRT1缺失可导致NHERF2降解异常发生累积，进而影响SR-BI蛋白功能，最终抑制Leydig细胞胆固醇摄入。 因此，我们的研究结果发现Sirt1可以通过自噬来调节睾酮生成过程，揭示了Sirt1在雄性小鼠生殖过程中的新机制。
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