摘要
疟疾，是世界上最重要的蚊媒病之一。蚊媒病的防治与管理主要依赖媒介蚊虫的控制，而媒介蚊虫的控制主要依赖拟除虫菊酯杀虫剂室内喷洒(indoorresidualspraying，IRS)和药浸蚊帐(insecticide-treatedmosquitonets，ITNs)对成蚊进行控制。然而，持续、广泛的杀虫剂使用导致了全球蔓延的杀虫剂抗性。到目前为止，中华按蚊等主要疟疾病媒几乎对所有种类杀虫剂产生了抗药性，对蚊媒病的防治与管理构成了严重威胁。尽管如此，药浸蚊帐等化学防治技术仍是防治疟疾等蚊媒病的有效途径。因此，揭示拟除虫菊酯抗性机制，能为我们认识杀虫剂抗性的产生，监测杀虫剂抗性以及延缓其发展提供重要参考。 中华按蚊是我国及东南亚固家的优势蚊虫，是我国疟疾、马来丝虫病、曰本脑炎等疾病的主要传播媒介。中华按蚊杀虫剂抗性的研究发现了大量拟除虫菊酯抗性候选基因，主要涉及靶标抗性和代谢抗性。但以往的研究多关注存在转录差异的基冈以及发生突变的钠离子通道基因，疏于在基因组水平发现中华按蚊拟除虫菊酯抗性相关的遗传变异，候选基因的发现存在一定偏向性，代谢抗性背后的遗传基础少有发现，基因组水平单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)、插入缺失(insertionanddeletion，InDel)和拷贝数变异(copynumbervariation，CNV)等可作为抗性分子标记的基因组变异尚未调查。本文以中华按蚊为研究对象，基于全基因组重测序技术，通过检测中华按蚊拟除虫菊酯抗性相关的基因组变异，对中华按蚊拟除虫菊酯抗性机制进行了探讨，主要内容与结果如下: ①对中华按蚊36个野外样本进行重测序、遗传变异检测，得到群体SNPl4，954，868个，群体InDell，807，958个。基于群体SNP，通过系统发育树、主成分分析和群体遗传结构对群体遗传多样性进行分析，结果显示中华按蚊36个野外样本分为三组，聚类关系大致与地理区域一致，说明种群间遗传差异大于种群内差异，种群间在抗性机制上可能存在独立进化，但重庆种群内的异质性提示种群问可能存在一定程度的基因交流。连锁不平衡分析显示，中华按蚊野外抗性品系和野外敏感品系均不存在明显的连锁不平衡。 ②通过野外抗性和相应敏感品系的比较，检测中华按蚊拟除虫菊酯抗性相关的基因组变异。结果发现:1)FS与FR之间存在3535个差异性非同义替换SNPs(△non-SNPs)，受影响基因2215个，涉及解毒酶、转运蛋白、蛋白质代谢酶、氧化酶、表皮蛋白、嗅觉结合蛋白等基因家族，其中受到95个△non-SNPs影响的20个基因为三个种群共有，As10011381编码的C2H2型锌指蛋白可能作为转录抑制子调控P450的表达。3个解毒酶家族受到△non-SNPs影响，但仅出现在一个或两个种群中，以P450基因最多，且大多为CYP9、CYP6和CYP4家族成员。kdr编码区的54个位点发现242个群体SNP，其巾non-SNP共52个，但均未表现出差异性。基因间区和内含子区差异性SNPs(△SNPs)分别为104668、193536个。2)1157个基因发生了扩增，其中593个基因在三个种群同时发生扩增。发生拷贝数变异的解毒酶基因家族有4个，其中最多的是P450，发生扩增的基因成员大部分属于CYP6、CYP9和CYP4。CYP6P3vl、CYP623和Ace2的过表达至少部分由基因扩增引起，具有进一步研究的意义。大多发生扩增的解毒酶基因并未相应地出现过表达，可能受到甲基化等作用的抑制。 ③基于可能参与基因表达调控的差异性变异(基因间区和内含子区△SNP，CNV)，对RNA-seq和RT-qPCR检测为差异转录的125个基因的表达调控机制进行初步分析。结果显示，基因间区△SNP是基因表达最主要的调控因子，111个基因至少在一个种群存在一种差异性变异。对5个基因家族(P450、CCE、GST、UGT和ABC转运蛋白)的11个基因成员进行具体分析发现，CYP6AA2、CYP622、CYP9J5、CYP4H24、Ace2、Ae10和UGT308D3的表达很可能受到基因间区和内含子区△SNP的正向调控，其中以基因间区△SNP为主，CYP622和AelO可能受到转录因子结合位点上ASNP的调控。CYP6P3vl的上调很可能受到基因扩增的调控。ABCG28的上调则很可能受到内含子区△SNP的调控。Un5和GSTd6的下调表达可能受到基因问区△SNP调控。一些基因存在多种变异类型说明变异类型之间可能相互协作对这些基因的表达进行调控。此外，CYP6AA2和ABCG28在个别种群出现△non-SNP，说明编码区变异可能与调控基因表达的变异类型一起介导这些基因在抗性中的作用。 综上所述，本研究对中华按蚊36个样本进行了变异检测，并在此基础上通过抗性品系和敏感品系的比较，发现了基因组水平可能介导中华按蚊拟除虫菊酯抗性的遗传变异和抗性基因，初步分析了差异表达基因的分子调控基础。本文研究结果扩充了中华按蚊遗传变异数据，加深了对中华按蚊拟除虫菊酯抗性机制的认识，有助于对杀虫剂抗性产生的机理进行更为广泛、深入的研究，为我国监测、防治和消除疟疾等重大蚊媒病提供了重要参考数据。
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