摘要
目的： 牙周炎是以菌斑生物膜为始动因素的多因紊陧性炎症性疾病，炎症和宿主免疫反应在牙周炎发展过程中起重要作用，可造成牙周组织的破坏。 人牙周膜成纤维细胞(human Periodontalligament fibroblasts，hPDLFs)是牙周膜中数量最多的细胞，具有多向分化潜能，是牙周再生功能性细胞的主要来源，但其分化过程受牙周微环境的影响。牙周炎发展过程中，大量炎症因子释放。许多研究表明，其中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)在牙周炎进展中起关键作用，既促进破骨分化，又可抑制成骨分化。所以需要寻找一些既可抑制炎症，又可以促进成骨分化的策略，为牙周炎的治疗提供新思路。 原花青素(Proanthocvanidins，PA)属于类黄酮类化合物。PA已被证明具有抑制炎症的作用，同时一些文献表明其在类风湿关节炎和牙周炎大鼠模型上具有促成骨作用，但对炎性环境下hPDLFs成骨分化作用尚未见研究。因此，本实验旨在探究PA在非炎症或炎症状态下是否可以促进hPDLFs成骨分化及其作用机制。 方法： (1)hPDLFs的分离、培养、鉴定 取14-20岁正畸患者健康前磨牙牙周膜组织块培养，获得hPDLFs，克隆形成实验确定其增殖能力。流式细胞术检测hPDLFs干细胞表面标记物。茜素红染色，油红。染色鉴定其多向分化潜能。 (2)PA对hPDLFs成骨分化的作用 浓度梯度的PA作用于hPDLFs3天、7天，qRT-PCR和Westem blot检测成骨相关标志物ALP，RunX2，OPN mRNA和蛋白表达。ALP活性检测试剂盒检测ALP活性。 (3)PA对TNF-α抑制hPDLFs成骨分化的影响 PA组、TNF-α组和TNF-α+PA组作用hPDLFs3天、7天和14天。qRT-PCR和Westem blot检测各组ALP,Runx2，OPN基因和蛋白，ALP活性试剂盒检测ALP活性，茜素红染色和钙定量分析比较各组矿化程度。 (4)PA对逆转TNF-α抑制hPDLFs成骨分化作用机制的研究 通过Westem blot检测PA是否通过NF-κB信号通路逆转TNF-α抑制hPDLFs成骨分化。 结果： (1)成功通过组织块培养法获得hPDLFs。克隆形成实验表明，hPDLFs具有良好的增殖能力。间充质干细胞表面标记CD-44，CD-90，和CD-105高表达，造血细胞表面标记CD-34和CD-45低表达，说明hPDLFs具有间充质干细胞特性。茜素红染色和油红。染色说明hPDLFs具有多向分化潜能。 (2)CCK8结果说明在50μg/ml以下PA对hPDLFs活性无抑制作用。ALP活性检测表明0.1-10μg/ml PA对hPDLFs ALP活性有促进作用。qRT-PCR和westem blot结果显示，0.1-10μg/ml PA对hPDLFs ALP，RunX2，OPN基因、蛋白表达和ALP活性有促进作用。 (3)与对照组比较，10ng/ml TNF-α作用下hPDLFs ALP，Runx2，OPN基因和蛋白表达下降，但1嵋/ml PA逆转TNF-α对hPDLFs成骨的抑制作用，ALP，Runx2，OPN基因、蛋白表达较TNF-α组有明显的升高。ALP活性检测和茜素红染色结果与基因蛋白结果相似。 (4)与对照组比较，TNF-α激活了NF-κB信号通路中IκBα和p65的磷酸化及p65的核转位，但是相较于TNF-α组，PA+TNF-α组这些蛋白的表达明显下降。 结论： 低浓度的PA促进hPDLFs成骨分化，并且可以通过抑制TNF-α激活的IκBα和p65的磷酸化及p65的核转位来逆转TNF-α抑制成骨分化的作用。
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