摘要
背景及目的: 全身服毒血症继发的急性肺损伤(sepsis-induced acute lung injury)和急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是危重病人死亡的重要原因。ALI是一种弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤，以肺水肿和肺不张为特征，ARDS是一种严重的危及生命的疾病。研究表明，炎症、线粒体损伤和凋亡参与到ALI/ARDS发病过程中。尽管最近取得了进展，但ALI/ARDS患者的死亡率仍然很高。细胞线粒体自噬降解和去除受损的线粒体，在细胞内平衡中发挥重要作用。然而，过度的线粒体吞噬可能促进线粒体功能障碍，导致细胞损伤和死亡。在本研究中，假设在LPS介导的服毒症肺损伤中，Bcl-2通过抑PINK1/Parkin介导线粒体自噬，从而减轻凋亡以及急性肺损伤。而Bad通过与Bcl-2结合，拮抗Bcl-2的抑制线粒体自噬作用，促进LPS诱导的细胞凋亡和急性肺损伤。拟通过在体和体外实验，验证Bcl-2、Bad通过PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬在脂多糖诱导的急性肺损伤的调节机制，为服毒症肺损伤患者的机制和治疗策略的研究提供了新的方向。 方法: 1.服毒症急性肺损伤细胞和动物模型的验证:使用LPS刺激A549细胞以及对C57BL/6小鼠进行LPS腹腔注射。在细胞水平上，使用CCK-8细胞活率测定，乳酸脱氢酶细胞毒性测定检测细胞的活率，使用蛋白质免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白以及凋亡荧光探针annexin v-fitc检测细胞凋亡情况:在动物水平上，使用肺组织地E染色及病理评分、肺泡灌洗液蛋白含量测定、肺组织湿干重比检测小鼠肺损伤情况。 2.LPS致线粒体自噬验证:在细胞水平上，使用透射电镜观察线粒体自噬体，免疫荧光双荧光探针CLC-3，线粒体外膜蛋白TOM20)以及Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白。同时，使用ATP总量检测、mitoROS检测和线粒体膜电位测定检测线粒体功能情况:在动物水平上，使用透射电镜观察线粒体自噬体。 3.LPS致Bcl-2、Bad表达改变以及PINK1/Parkin通路教导的线粒体自噬的激活:在细胞水平上，使用Western Blot,RT-qPCR法检测Bcl-2、Bad和PINKl的表达。同时，使用线粒体提取和免疫荧光技术，检测Parkin的位移:在动物水平，使用免疫组化检测Bcl-2、Bad和PINK1的表达。 4.过表达Bcl-2，对线粒体自噬、细胞凋亡以及急性肺损伤的调节检测:在细胞水平上，使用慢病毒过表达载体过表达Bcl-2并验证。检测过表达后细胞凋亡的情况以及线粒体自噬以及线粒体功能情况:在动物水平上，使用慢病毒过表达载体对小鼠尾静脉进行注射，取肺组织检测过表达情况。检测过表达后小鼠肺损伤以及线粒体自噬和线粒体功能情况。 5.干扰Bad表达，对线粒体自噬、细胞凋亡以及急性肺损伤的调节检测:在细胞水平上，使用慢病毒干扰载体过表达Bcl-2并验证。检测干扰后细胞凋亡的情况以及线粒体自噬以及线粒体功能情况:在动物水平上，使用慢病毒干扰后载体对小鼠尾静脉进行注射，取肺组织检测过表达情况。检测过表达后小鼠肺损伤以及线粒体自噬和线粒体功能情况。 6.Bcl-2、Bad蛋白通过PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬在脂多糖诱导的急性肺损伤的调节机制的研究:在细胞水平上，过表达Bcl-2或干扰Bad表达后检测Parkin的位移情况。同时，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对A549细胞的Park2(Parkin)基因进行敲除并验证。使用Bad模拟物ABT-737拮抗Bcl-2的功能。检测过表达Bcl-2后细胞线粒体自噬以及细胞凋亡情况;在动物水平上，购买Parkin基因敲除小鼠，检测过表达Bcl-2后细胞线粒体自噬以及肺损伤情况。最后，使用免疫共沉淀技术检测Bcl-2、Bad、Parkin的蛋白互作。 结果: 1.LPS致A549细胞活率下降，细胞凋亡。在小鼠腹腔注射LPS后致小鼠H&E染色病理评分、肺泡灌洗液总蛋白以及肺组织湿干重比较对照组明显增加。 2.LPS致线粒体自噬激活。免疫荧光结果可见线粒体相关蛋臼和自噬相关蛋白共定位增多，透射电镜可见线粒体自噬体明显增多，以上均提示线粒体自噬增多。Western Blot、mitoROS、ATP总量检测、线粒体膜电位检测均提示线粒体功能严重受损。 3.LPS剌激致Bcl-2表达上调、Bad表达下调;PINK1表达上调，Parkin从胞浆向线粒体位移增多。 4.过表达Bcl-2可明显减轻LPS引起的细胞凋亡和小鼠的急性肺损伤，减轻线粒体自噬。通过使用线粒体自噬诱导剂诱导线粒体自噬后发现，Bcl-2缓解细胞凋亡和肺损伤的作用被逆转。提示Bcl-2通过减轻线粒体自噬来缓解细胞凋亡和急性肺损伤。 5.敲低Bad的表达可明显减轻LPS引起的细胞凋亡和小鼠的急性肺损伤情况。 6.过表达Bcl-2或敲低Bad的表达可明显减轻Parkin向线粒体的易位。在敲除Parkin后，Bcl-2即使被拮抗，线粒体自噬的情况仍然得到缓解，提示Bcl-2通过调节PINK1/Parkin通路来调节线粒体自噬，从而调节细胞凋亡和急性肺损伤。最后，发现，Bcl-2和Bad，Bcl-2和PINK1存在直接作用关系。 结论: 在本研究中，发现了线粒体自噬参与了败血症引起的急性肺损伤(ALI)。Bcl-2家族蛋白在线粒体稳态中起重要作用。本研究采用脂多糖(LPS)诱导A549细胞和小鼠ALI损伤。LPS处理后可导致细胞凋亡升高、线粒体自噬增强、Bcl-2表达降低、Bad表达增加以及细胞和肺组织中PINK1/Parkin信号通路的激活。通过Bcl-2过表达和Bad低表达均能减轻脂多糖诱导的损伤，抑制细胞凋亡和线粒体吞噬，提高存活率。此外，Bcl-2和Bad蛋白通过调节Parkin从细胞质到线粒体的调节线粒体自噬。这些结果在Park2KO的A549细胞和Park2-/-小鼠中得到进一步证实。本研究首次证实了Bcl-2蛋白通过调节PINK1/Parkin信号通路来调节脂多糖诱导的急性肺损伤中的线粒体自噬，为服毒症肺损伤患者的机制和治疗策略的研究提供了新的方向。
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