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生防假单胞菌利用环二肽cEL调控群集运动的机理研究

袁永明

生防假单胞菌利用环二肽cEL调控群集运动的机理研究

袁永明1
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作者信息

  • 1. 南京农业大学
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摘要

生防假单胞菌Pseudomonas protegens Pf-5菌株,先前命名为荧光假单胞菌(P.fluorescens)Pf-5,该菌株对卵菌、真菌和细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果。Pf-5菌株全基因组已知,能遗传操作,是研究生防假单胞菌的模式菌株。大量的研究表明,生防细菌的群体感应系统(Quorum-sensing System,QS系统)对于调控抗菌物质的合成,以及重要生防性状的形成如群集运动(Swarming motility)等起着重要作用。而迄今为止,P.protegens类生防菌株中的QS系统还未报道。生物信息学分析也表明,部分假单胞菌种已报道的4套QS系统在P.protegens类生防菌株中也不存在。因此,研究P.protegens类生防菌株的QS系统,一方面有助于发现新的QS信号分子,另一方面有助于阐明这类系统在调控物质合成和重要形状形成中的作用。 生物信息学分析表明Pf-5菌株中存在一个未知功能的环二肽合成酶(Cyclicdipeptide synthases,CDPSs)。已有研究表明,一些环二肽能具有种间的QS信号分子的功能。为了研究该酶合成的产物的功能。我们首先对产物的结构进行了鉴定。我们利用大肠杆菌表达系统,表达了该CDPSs.利用HPLC-MS和MS2对发酵液进行了检测。初步结果表明,该CDPSs生成cEL(cyclo-L-Leu-L-Glu)。利用制备HPLC对纯化产物的核磁共振氢谱分析和氨基酸组份分析进一步证实,该酶催化合成的产物为cEL。我们又构建了该酶的多个定点突变体.HPLC-MS检测结果表明,四个保守性氨基酸Ser32、Tyr170、Tyr174和Tyr192对产物的形成起着关键作用,是该酶的活性中心,在该酶预测结构中的a-4螺旋中的三个阴性(E78,D86和D88)和两个阳性氨基酸(R85和R93),以及a-6与a-7螺旋间loop环中的两个阴性(E149和D159)和一个阳性(R150)基团对于该酶的活性也起着重要作用。 活性研究表明,该CDPSs生成的cEL对病原真菌和细菌都不具有抑制活性,但能促进植物的生长,最适作用浓度为75nmol/L。利用群体感应信号AI-2的报告菌株哈维氏孤菌BB170的检测结果表明,纯化的cEL、Pf-5菌株、回补体Pf-5△cdps/p-cdps都能显著诱导报告菌株的生物发光现象:而突变体Pf-5Acdps以及在该突变体中回补酶突变体编码基因,这些菌株的这种活性显著下降。进一步利用大肠杆菌表达系统的验证结果表明,当突变BL21菌株中负责合成AI-2信号分子的luxS基因后,突变体BL21△luxS的诱导生物发光的现象显著下降:在该突变体中转入cdps基因后,能恢复诱导活性:而转入酶突变体编码基因则不能恢复该活性。这说明cEL具有种间的QS信号分子的功能。那么,cEL在Pf-5菌株中具有什么功能呢?研究表明,Pf-5△cdps的群体运动能力完全丧失,添加cEL或回补体Pf-5△cdps/p-cdps均能恢复该菌株的这种运动能力,突变体中回补突变酶编码基因则不能恢复菌株的群集运动能力。这说明Pf-5菌株环二肽合成酶生成的cEL具有调控菌株群集运动的功能。 上述研究结果表明,cEL具有AI-2相似的QS信号分子的功能。在哈维氏弧菌中,由LuxS蛋白合成的AI-2信号分子与群体感应受体LuxP/LuxQ系统(由信号受体/组氨酸激酶)互作后,调控荧光素酶基因的表达。生物信息学分析表明,Pf-5菌株因为缺少LuxS蛋白,不能合成AI-2信号分子,但却存在与LuxP/LuxQ功能结构域相似的蛋白(PFL_3664/PFL_1738)。我们推测,Pf-5菌株利用环二肽合成生成的cEL,在与LuxP/LuxQ互作后,调控菌株的群体运动能力。研究表明,Pf-5△luxP和Pf-5△cdps△luxP突变体的群集运动能力几乎完全丧失,回补体Pf-5△luxP/p-luxP和Pf-5△cdps△luxP的这种运动能力能恢复:而相关突变体中回补的luxP基因不带信号肽编码序列时,即使是添加cEL或者是共回补cdps基因,也不能恢复菌株的这种运动能力。ITC结果也证明,cEL能与LuxP结合。进一步的Westem blot分析表明,LuxP能外泌到周质空间。这些结果初步说明,Pf-5菌株的LuxP在信号肽的作用下,分泌到周质空间,在与信号分子cEL互作后调控菌株的群集运动。深入研究表明,突变体Pf-5AluxO的群集运动能力也丧失,而相应的回补体的这种运动能力能恢复。细菌双杂实验也表明,LuxP和LuxQ蛋白位于周质空间部分能互作。这些结果表明,信号分子cEL在周质空间与LuxP/LuxQ互作后,调控菌株的群集运动能力。对于该信号通路的下游因子,在本研究当中能为提高生防假单胞菌的活性物质产量以及环境竞争能力提供理论支撑。

关键词

生防假单胞菌/环二肽/群集运动/分子调控机制

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授予学位

硕士

学科专业

植物保护;植物病理学

导师

伍辉军

学位年度

2018

学位授予单位

南京农业大学

语种

中文

中图分类号

S4
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