摘要
宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科枸杞属多年生木本植物，是重要的药食同源植物资源。枸杞果实的药用价值、色泽、风味口感等品质受果实中糖的含量、种类影响，枸杞果实品质形成的关键是糖积累，而蔗糖代谢又是糖积累的重要环节。目前对枸杞果实蔗糖代谢积累的分子机制尚不清晰，本研究以“宁杞1号”枸杞为材料构建了SSH文库，获得果实不同发育时期基因表达谱;克隆了中性转化酶(NI)基因，对其进行生物信息学及时空表达模式分析;同时以不同发育时期“宁杞1号”、“宁杞3号”枸杞果实为材料，系统对两个品种枸杞果实糖含量、蔗糖代谢关键酶基因(Lb SAI,Lb NI,Lb SPS和Lb SuSy)基因表达和酶活性变化规律进行了研究，发现蔗糖代谢关键酶基因在枸杞中存在品种差异性;并将Lb SAI和Lb SPS两个基因转入烟草、枸杞中深入分析其功能，具体研究结果如下: 1、以宁夏枸杞的果实、花、叶为材料，利用SSH技术成功构建枸杞果实SSH文库，通过测序总共获得1066条EST序列，其中高质量的EST序列有1051条，重组率为98.59％，获得单基因有654条，其中冗余的占37.78％。单基因的平均长度为548.07bp,获得586条ORF序列，ORF的平均长度为324.88bp。这些基因参与氨基酸核苷酸代谢、防御机制、能量代谢、细胞骨架、信号转导、脂质代谢、胞内转运、分泌和囊泡运输等生理过程。为枸杞果实糖代谢分子机制的研究提供基因数据。 2、利用RACE技术克隆枸杞中性转化酶基因(Lb NI GenBank登录号为KR026955)基因开放阅读框1653bp，编码545个氨基酸。Lb NI蛋白二级结构预测发现不规则卷曲结构占39.63％，α螺旋占36.51％，延伸链结构占18.53％，B转角最少，仅5.32％。生物信息学分析显示Lb NI蛋白含糖苷酶100超家族保守结构域，与番茄、烟草等NI蛋白相似度较高，无酸性转化酶保守结构域NDPNG/A、FRDP和WECP。Lb NI基因在枸杞果实形成的各个阶段均有表达，且存在器官、组织差异，在叶和果皮中表达量较高，表明中性转化酶参与枸杞多种发育过程。枸杞果实发育过程中酶活性的变化与基因表达模式相吻合，说明枸杞中性转化酶基因Lb NI表达不存在二级调控机制，转录水平的调控是该酶活性调节的主要环节。 3、对2个枸杞品种果实发育过程中糖含量、蔗糖代谢关键酶基因表达和酶活性进行分析表明，“宁杞1号”枸杞果实保持较高的己糖（葡萄糖和果糖）水平，而蔗糖水平低于“宁杞3号”。在枸杞果实发育过程中Lb SPS和Lb NI基因的表达与酶活性变化的规律一致相关，而Lb SAI和Lb SuSy基因的表达与酶活性变化的规律并不一致。表明枸杞蔗糖代谢关键酶基因表达具有品种差异性，酶活性由多水平调节，枸杞果实发育过程NI基因和SPS基因可能在糖代谢中起主要作用。 4、通过农杆菌介导法将分别将Lb SAI、Lb SPS基因转入烟草中，获得阳性转基因植株，阳性转化率分别为77.8％和63.6％。利用qPCR检测对阳性植株中基因表达分析发现7个转Lb SAI基因株系叶片SAI基因的表达量均高于野生型，但转基因株系SAI酶活性与野生型相比并未表现出显著增高;对7个转Lb SPS基因阳性株系分析发现SPS基因在转录水平上的表达量增加，相对应SPS酶活性亦增加，进一步明Lb SAI酶活性调节可能在蛋白水平，Lb SPS酶活性调节在转录水平。 5、通过农杆菌介导法将Lb SPS、Lb SAI基因转入“宁杞1号”枸杞中，获得了阳性愈伤组织，并得到了不定芽，目前未获得阳性的植株。不同农杆菌菌株转化效率比较发现AGLI比EHA105和GV3101更容易携带外源基因进入枸杞叶片中。Lb SPS、Lb SAI基因在枸杞中的功能，还需进一步的研究。 研究结果为全面理解枸杞果实发育过程中蔗糖代谢基因作用机制提供研究基础，为进一步揭示枸杞果实糖代谢的分子机理积累资料和实验材料，为枸杞转基因研究奠定。对进一步揭示枸杞多糖合成机制具有重要理论意义。
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