摘要
目的： 1.体外研究明确左归丸促小鼠BMSCs增殖和成骨分化的作用并探讨FoxJ1调控BMP/Smad信号通路在左归丸促进BMSCs成骨分化的作用机制; 2.体内研究探讨FoxJ1调控BMP/Smad通路在左归丸治疗小鼠骨质疏松的作用; 方法： 1.细胞实验研究 (1)左归丸调控FoxJ1/BMP/Smad信号轴促小鼠BMSCs成骨分化 取8周龄小鼠分离培养BMSCs，观察细胞形态，流式细胞术检测BMSCs表面标记CD29、CD44、Sca-1和CD117;CCK8法检测不同浓度左归丸在1d、2d、3d、5d7d对小鼠BMSCs的增殖作用，筛选最佳浓度;实验分组：对照组（CON组）、成骨诱导组（OI组）、左归丸组（ZGW组）、左归丸+成骨诱导组（ZGW+OI组），成骨诱导液诱导BMSCs成骨分化，ALP染色检测BMSCs成骨能力，茜素红染色检测骨矿化;荧光定量PCR检测小鼠BMSCs成骨相关指标碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)以及成骨相关转录因子(Osx)以及叉头盒J1(FoxJ1)mRNA的表达，Western-blot检测FoxJ1、骨形成蛋白2(BMP2)、Smad1和p-Smad1/5蛋白的表达; (2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路促进BMSCs成骨分化 采用siRNA转染(1)中的小鼠BMSCs，实验分组：空载体(siCtrl)组、FoxJ1转染(siFoxJ1)组，ZGW+siCtrl组、ZGW+siFoxJ1组，荧光定量PCR检测FoxJ1mRNA的表达，Western-blot检测FoxJ1蛋白的表达;对上述分组成骨诱导，ALP染色检测成骨分化能力，茜素红染色检测骨矿化，Western-blot检测BMP/Smad通路相关蛋白的表达。 2.动物实验研究 (1)骨质疏松模型的构建以及对FoxJ1表达的影响 6周龄雌鼠采用去卵巢术构建小鼠骨质疏松模型，micro-CT检测椎体骨微细结构，HE染色检测椎体骨组织形态学，western-blot检测FoxJ1蛋白的表达 (2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路抗骨质疏松的作用 上述去卵巢小鼠SiRNA尾静脉注射，左归丸灌胃，实验分组：siCtrl组，siFoxJ1组，ZGW+siCtrl组，ZGW+siFoxJ1组;micro-CT检测椎体骨微细结构，HE染色检测椎体骨组织形态学，western-blot检测FoxJ1、BMP2、Smad1和p-Smad1/5蛋白的表达。 结果： 1.细胞实验研究 (1)左归丸调控FoxJ1/BMP/Smad信号轴促小鼠BMSCs成骨分化 BMSCs呈梭形，旋涡状生长，流式细胞术结果显示，CD29阳性率98.1％，CD44阳性率98.6％，Sca-1阳性率97.3％，CD117阳性率8.5％;CCK8检测结果采用两因素重复测量方差分析，表明不同浓度左归丸干预不同时间对细胞增殖均存在显著差异，且不同浓度左归丸对细胞增殖的影响随着时间的变化而变化，存在交互作用，以10μg/ml左归丸干预5天对促进细胞增殖的作用最显著;ALP染色结果显示：ALP染色效果随着成骨诱导时间的增加而增加，从整体观看，在成骨诱导第7天和第14天，OI组培养皿颜色明显深于CON组，在第14天，OI组能看到明显的紫色细胞团;从镜下看，与CON组比较，OI组ALP染色细胞明显增多，颜色加深;从整体观看在成骨诱导第7天和第14天，ZGW组与CON组没有明显颜色差异，但是从镜下看，ZGW组染色细胞明显多于CON组，且颜色较深;与OI组比较，从整体观看，成骨诱导第7天ZGW+OI组与单纯OI组没有明显颜色差异，而成骨诱导第14天，与OI组相比，ZGW+OI组ALP染色细胞明显增多，颜色加深;从镜下看，在成骨诱导第7天和第14天，与OI组相比，ZGW+OI组ALP染色细胞均明显增多，且颜色加深。 (2)SiRNA转染BMSCs后，荧光定量PCR显示：与siCtrl组相比，siFoxJ1组中FoxJ1mRNA的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01);与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组中FoxJ1mRNA的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。Western-blot显示与siCtrl组相比，siFoxJ1和ZGW+siCtrl组中FoxJ1蛋白的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01);与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组中FoxJ1蛋白的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)。ALP染色结果显示在成骨诱导第7天，从整体观看，与siCtrl组比较，siFoxJ1组培养皿颜色明显较深，染色范围增大;从镜下看，与siCtrl组比较，siFoxJ1组ALP染色细胞明显增多，颜色加深;从整体观看，ZGW+siCtrl组与siCtrl组没有明显颜色差异，但是从镜下看，ZGW+siCtrl组ALP染色颜色较深;与siFoxJ1组比较，从整体观看，ZGW+siFoxJ1组与siFoxJ1组没有明显颜色差异，从镜下看，ZGW+siFoxJ1组ALP染色颜色明显加深。茜素红结果显示在成骨诱导第14天，与siCtrl组比较，从整体观看，siFoxJ1组细胞红染颜色明显加深，从镜下看，siFoxJ1组茜素红染色更明显，且染色细胞数量增多;与siCtrl组比较，ZGW+siCtrl组在整体观下没有明显变化，在镜下看，ZGW+siCtrl组矿化结节明显增多;与siFoxJ1组比较，从整体观看，ZGW+siFoxJ1组红染范围明显增大，且颜色较深，从镜下看，ZGW+siFoxJ1组茜素红染色颜色较深，染色细胞数增多，矿化结节增多范围增大。Western-blot结果显示与siCtrl组比较，siFoxJ1和ZGW+siCtrl组BMP2蛋白表达、p-Smad1/5/Smad1均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05)，Smad1总蛋白的表达未见明显变化;与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组BMP2蛋白的表达和p-Smad1/5/Smad均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05） 2.动物实验研究 (1)骨质疏松模型的构建以及对FoxJ1表达的影响 MicroCT结果显示，与假手术(Sham)组比较，去卵巢(OVX)组骨微细结构参数BV/TV(％)、Tb.N(mm)、Tb.th(mm)和Tb.sp(mm)均明显下降，差异具有统计学差异（P＜0.01）;此外，三维重建图显示与Sham组相比，Ovx组骨小梁稀疏，不连续，骨小梁数量明显减少，宽度变窄，骨小梁与骨小梁之间间隙变宽。在4倍镜和10倍镜下可见，与Sham组比较，Ovx组骨小梁损毁严重，发生断裂，不连续，骨小梁变窄，问隙变宽，骨小梁数量明显减少;20倍镜下可见，与Sham组比较，OVX组可见破骨细胞明显增多，可见明显骨缺损：Western-blot结果显示与Sham组比较，OVX组FoxJ1蛋白的表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 (2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路抗骨质疏松的作用 MicroCT结果显示与siCtrl组比较，siFoxJ1和ZGW+siCtrl组BV/TV明显升高，Tb.sp明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），Tb.N和Tb.th虽无统计学差异，但是有上升的趋势;与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组BV/TV、Tb.sp均明显升高（P＜0.01，P＜0.05），Tb.N和Tb.th虽无统计学差异，但是有上升的趋势。三维重建图显示与siCtrl组相比，siFoxJ1组骨小梁变得密集，连续，骨小梁数量增加，骨小梁与骨小梁之间间隙变窄;ZGW+siCtrl组骨小梁连续性较好;与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组骨小梁数量增加，骨小梁间间隙变窄。HE染色结果显示，siCtrl组骨小梁断裂，排列不规则，骨小梁数量减少;与siCtrl组相比，siFoxJ1组骨小梁排列有所改善，整齐连续，ZGW+siCtrl组骨小梁排列整齐，骨小梁数量增多;与siFoxJ1组比较，ZGW+siFoxJ1组骨小梁稍变宽，其余未见明显改善。Western-blot结果显示与siCtrl组比较，siFoxJ1组和ZGW+siCtrl组FoxJ1蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），BMP2蛋白表达和p-Smad1/5/Smad1明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05)：与siFoxJ1组比较，FoxJ1蛋白表达、BMP2蛋白表达和p-Smad1/5/Smad1虽有改变趋势，但均无统计学差异。 结论： 1、体外研究证实沉默FoxJ1能促进小鼠BMSCs成骨分化;左归丸通过抑制FoxJ1激活BMP/Smad信号通路，促进小鼠BMSCs成骨分化; 2、体内研究证实高表达FoxJ1是导致去卵巢小鼠骨微细结构和骨组织形态学损害的重要机制：而左归丸通过制FoxJ1激活BMP/Smad信号通路，改善小鼠骨质疏松。
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