摘要
本研究结合体内与体外实验，探索艾地苯醌是否可以作为一种线粒体靶点的抗氧化剂用于AS性疾病的防治，同时我们进一步应用体内动物实验及体外细胞实验阐明了艾地苯醌抗AS的分子机制。我们将以下面4个部分进行详细阐述: 第一部分 艾地苯醌抑制AopE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成并增强斑块稳定性研究 研究目的： 探索艾地苯醌对AopE-/-动脉粥样硬化模型小鼠斑块形成及斑块稳定性的影响。 研究方法： 1.艾地苯醌溶液的制备 艾地苯醌由齐鲁制药有限公司提供，纯度≥98％，用玉米油溶解，通过灌胃的方式给药。 2.样本量计算 在预实验中，我们将20只AopE-/-小鼠分为4组，每组5只:(1)高脂饮食组;(2)高脂饮食+艾地苯醌低剂量组(100mg/kg/d);(3)高脂饮食+艾地苯醌中剂量组(200mg/kg/d);(4)高脂饮食+艾地苯醌高剂量组(400mg/kg/d)。高脂配方饮食喂养16周后主动脉置多聚甲醛中，每组小鼠主动脉行大体油红O染色以统计主动脉斑块负荷量。 研究结果： 1.样本量计算 在预实验中，我们以大体油红O染色统计得出的斑块负荷量数据为基准，采用单因素多水平设计方法计算正式实验样本量。通过PASS软件计算样本量得出正式实验每组小鼠数量2只以上既有统计学意义。 2.实验小鼠的基本情况正式实验为60只AopE-/-小鼠，随机分为4组，所有小鼠均顺利完成实验(n=15)。到实验结束时，各组小鼠体重各组间比较并无统计学差异(P＞0.05)。 本部分小结： 在AopE-/-AS模型小鼠实验中，艾地苯醌不会影响AopE-/基因敲除鼠体重、血糖及血脂的变化。但通过主动脉根部切片HE染色及大体油红O染色，发现艾地苯醌可以有效的抑制AS斑块的形成，并且改善斑块组织成分，使斑块成分中脂质、巨噬细胞及炎症相关因子的含量表达下降，使胶原、平滑肌的成分比例升高，让斑块成分稳定。 第二部分 艾地苯醌抗动脉粥样硬化作用的蛋白质组学研究及生物信息学分析 研究目的： 为进一步探索艾地苯醌抗AS发生发展的分子通路，我们对高脂饮食组和IDE高浓度组进行蛋白质组学分析及生物信息学分析。 研究方法： 本研究部分为本课题组与景杰生物科技有限公司合作行蛋白质组学分析及生物信息学分析。 1.取材 我们随机在IDE高浓度组和高脂饮食组中各选取3只AopE-/-小鼠主动脉组织行差异蛋白及生物信息学分析。 2.蛋白提取 提取艾地苯醌高剂量组和高脂饮食组小鼠主动脉组织蛋白，并检测其浓度。 研究结果： 1.蛋白质组学分析总览 蛋白质组学结果一共鉴定到5812个蛋白质，以1.3倍为差异表达变化阈值，IDE-H/HFD比较组中351个蛋白上调表达，379个蛋白下调表达。 2.样品重复性检验 采用皮尔森相关性（Pearson's Correlation Coefficient），相对标准差(RSD)和主成分分析(PCA)三种统计分析方法评估重复性，所送检样本均具有较好的重复性。 本部分小结： 此蛋白质组学分析一共鉴定到5812个蛋白质，其中5279个蛋白质包含定量信息。以1.3倍为差异表达变化阈值，IDE-H/HFD比较组中共有351个蛋白表达发生上调，379个蛋白表达发生下调。通过对HFD组及IDE-H组小鼠主动脉组织蛋白组学分析，发现差异蛋白主要定位于线粒体中;通过GO分析及KEGG分析，发现差异蛋白多涉及于氧化呼吸，线粒体电子传递链及炎症反应，这为我们寻求艾地苯醌抗AS靶点奠定了一定的理论依据。艾地苯醌抗动脉粥样硬化可能通过涉及SIRT3、SOD2和NLRP3等蛋白相关通路，需体内、体外实验进一步验证。 第三部分 艾地苯醌通过激活SIRT3-SOD2-NLRP3通路抑制AopE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成 研究目的： 本部分课题通过构建动脉粥样硬化小鼠模型，验证艾地苯醌是否可以改变SIRT3-SOD2-NLRP3通路相关蛋白，从而抑制AS斑块的发生发展。 研究方法： 1.实验动物模型的建立和分组 同第一部分小鼠分组及模型构建方法。 2.组织标本分子生物学检测。 采用Western Blot方法检测各组小鼠主动脉组织的SIRT3，FOX03A，SOD2，NLRP3，CASPASEl及IL-1β指标在蛋白水平的变化。 研究结果： 1.初步验证差异蛋白生物信息学分析中SIRT3-SOD2-NLRP3通路相关蛋白的改变。 将IDE-H组和HFD组送检的6只小鼠剩余主动脉组织性Western blot检测。发现SIRT3、SOD2和NLRP3蛋白的Western blot统计结果分析与蛋白质组学的数据分析保持一致性。 2艾地苯醌影响小鼠AS斑块中SIRT3-SOD2-NLRP3蛋白表达水平: 2.1.Western Blot统计结果显示，与高脂饮食组相比，各浓度艾地苯醌组斑块内SIRT3，FOX03A，SOD2蛋白的表达水平均显著升高:免疫组织化学染色统计结果显示，与HFD组相比，各浓度艾地苯醌组斑块内SIRT3百分比显著升高，另外，各浓度IDE组斑块内SOD2百分比也明显升高。 本部分小结： 在AopE-/-基因敲除小鼠中，艾地苯醌可以增强去乙酰化酶SIRT3蛋白的表达，从而使SOD2去乙酰化增强其活性。由于SOD2可以有效的清除线粒体中多余ROS，减少对NLRP3炎性小体的激活，故艾地苯醌可以通过调节SOD2的活性影响NLRP3炎症因子的表达，进而减缓下游炎症通路的激活，减缓了AS斑块的发生发展。 第四部分 利用人脐静脉血内皮细胞模型验证艾地苯醌抗动脉粥样硬化机制研究 研究目的： 本部分研究通过体外实验，构建人脐静脉血内皮细胞损伤模型，进一步验证艾地苯醌抗AS斑块形成的分子通路。 研究方法： 1.人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定。 2.建立人脐静脉血内皮细胞损伤模型及相关实验检测 (1)将人脐静脉血内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells.HL'VECs)分为3组:①正常对照组;②10μM胆固醇组:③10μM胆固醇+0.2μM艾地苯醌组。 (2)采用CCK-8(Cellcounting Kit-8，CCK8)检测各组血管内皮细胞增殖水平。 研究结果： 1.艾地苯醌可以提高清除氧自由基的能力，并且抑制脂质过氧化。 与正常组相比，10μM胆固醇组中内皮细胞增殖水平明显降低，SOD2活力显著降低，脂质过氧化的水平升高;与10UM胆固醇组相比，加入0.2μM的艾地苯醌细胞组MDA含量均显著降低，这表明细胞脂质过氧化水平下降，SOD2活性均明显增高，提示IDE能增强线粒体清除氧自由基能力，同时降低体内脂质过氧化水平，从而保护胆固醇诱导损伤的细胞损伤。 2.艾地苯醌可以抵抗氧化应激水平，保护线粒体功能，从而减少内皮细胞凋亡。 2.1与10μM胆固醇组内皮细胞相比，加用0.2μM的IDE细胞实验组的红色荧光强度显著提高，红绿荧光比值显著增高; 本部分小结： 在胆固醇造成的HUVECs损伤模型中，IDF可以改善线粒体功能，从而保护线粒体，继而增强清除氧自由基能力，降低线粒体氧化应激水平，从而减少内皮细胞凋亡水平。同时，艾地苯醌可以激活SIRT3-SOD2-mtROS通路，减少NLRP3等炎性因了产生，从而保护损伤的内皮细胞。 研究结论： 本研究我们围绕艾地苯醌抗动脉粥样硬化的作用及分子机制研究，展开了相应的实验设计及工作，并取得了一下的结果: 1.我们通过体内实验，证实了艾地苯醌药物干预可以抑制AopE-/-小鼠AS斑块生成。 2.我们通过检测AopE-/-小鼠AS斑块成分，发现艾地苯醌可以使斑块的脂质及炎症成分减低，使胶原及平滑肌细胞含量升高，使斑块更加稳定。 3.我们对艾地苯醌高浓度组与高脂饮食组AopE-/-小鼠主动脉进行差异蛋白生物信息学分析，分析结果可以发现:差异蛋白多涉及于氧化呼吸，线粒体电子传递链及炎症反应，这为我们进一步探索艾地苯醌抗动脉粥样硬化分子机制提供了研究线索。 4.我们通过体内实验及体外实验，证实了艾地苯醌可以激活SIRT3-SOD2通路，从而减少mtROS生成，使NLRP3炎症小体相关蛋白生成减少，进而抑制了下游的炎症反应分子机制，最终抑制了AopE-/-小鼠AS斑块的生成。 综上，艾地苯醌为机体内一种线粒体靶向抗氧化剂，有望成为防治AS的新型治疗药物，考虑到其有较少的副作用及较高的耐受性，因此艾地苯醌有较好的临床应用前景。
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