摘要
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种具有重要医用价值的激素类糖蛋白，由α亚基和β亚基组成。前期研究发现，在CHO细胞表达重组hCG蛋白表达过程中，多肽合成存在明显限制，其中β亚基抑制作用明显强于α亚基，导致hCG产量偏低。相比于α亚基，β亚基存在更多的O糖基化修饰位点，推测β亚基C端的。糖基化结构很可能是造成β亚基多肽合成限制的主要因素。重组hCG蛋白的O糖基化结构是粘蛋白型(Mucin-type)，粘蛋白型O糖基化主要有8种不同的母核结构，起始结构为GalNAc，主干结构多为Gal和GlcNAc的重复序列。本研究针对重组hCG蛋白表达过程中β亚基多肽合成的限制，通过调控重组CHO细胞的O糖基化修饰，从前体物质添加到前体物质合成以及糖链合成和延伸调控，对hCG蛋白整个O糖基化修饰过程进行了系统研究。 首先通过添加O糖基化前体物质初步确定重组hCG蛋白表达过程中。糖基化限制的存在以及O糖基化前体合成阶段可能存在的主要限制性酶。通过基因过表达手段，调控CHO细胞内。糖基化前体合成主要调控酶GFAT2和UGP2，通过研究改造细胞株对细胞生长、重组hCG蛋白表达水平、O糖基化水平和稳定性以及胞内蛋白总半乳糖基化水平的影响，发现调控UGP2可以通过提高hCG蛋白。糖基化水平，有效提高重组hCG蛋白表达量，过表达细胞株重组hCG蛋白表达量与对照组相比提高了92.2％，同时还增强了重组hCG蛋白稳定性，UGP2是O糖基化前体合成阶段的关键限制性酶。 进一步研究重组hCG蛋白。糖基化糖链合成阶段的限制性因素。首先研究确定了GALNT家族中GALNT1为重组hCG蛋白O糖基化糖链合成起始阶段的关键调控酶。随之，分别构建了过表达O糖基化糖链合成阶段主要调控基因galnt1/clgalt1/ogt和基因敲弱(Crispr/Cas9)糖链水解酶基因hex的单克隆细胞株。通过研究单基因以及协同作用改造细胞株对细胞生长、重组hCG蛋白表达水平、O糖基化水平和稳定性以及胞内蛋白总半乳糖基化水平的作用，发现调控GALNTl可以通过提高hCG蛋白O糖基化水平，有效提高重组hCG蛋白表达量，重组hCG蛋白表达量与对照相比提高了57.5％，同时还提高了重组hCG蛋白稳定性，GALNT1是O糖基化糖链合成阶段的关键限制性酶。 综合上述的研究发现，在重组hCG蛋白的O糖基化过程中，前体物质合成和糖链合成均存在明显限制。在重组hCG蛋白的粘蛋白型。糖基化结构中，主要前体GalNAc和Gal供应均存在明显限制。研究表明CHO细胞无法有效使用外源添加的Gal，主要通过Glc代谢合成Gal前体，该前体合成途径中UGP2是关键限制酶，调控UGP2表达能有效改善Gal前体供应。研究还发现，CHO细胞能有效利用外源添加的GalNAc，而Glc代谢合成GalNAc前体途径，由于反应过于复杂，导致该合成途径效率较低。此外，由于该途径还涉及NeuNAc前体合成，如通过外源添加补充GalNAc，这样既改善了GalNAc前体供应，同时还避免了NeuNAc前体合成的底物竞争，从而改善NeuNAc前体的供应。本研究为CHO细胞表达异源重组蛋白O糖基化研究和调控提供了一种有效方法和手段，具有重要的研究和应用价值。
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