摘要
背景： 慢性乙型病毒性肝炎是一种免疫介导肝脏损伤的疾病。宿主的免疫功能对乙型肝炎病毒(HBV)感染的控制和疾病的临床转归有重要作用。CD8+T细胞免疫反应在控制慢性 HBV感染中占据重要的地位，其功能"耗竭"是导致 HBV感染慢性化的重要原因。但不断有研究表明 CD8+T细胞是由表型和功能异质的亚群组成的。不同 CD8+T细胞亚群可能在 HBV感染中发挥不同作用。因此，深入探索CD8+T细胞的亚群可能有助于寻找慢乙肝治愈的新策略。 目的： 本研究通过慢性 HBV感染患者横向队列和抗病毒治疗患者的纵向队列探索CXCR5+CD8+T细胞在慢性 HBV感染和抗病毒治疗中的表型和功能特点:分析肝内 CXCL13表达对 CXCR5+CD8+T细胞的趋化作用及与预测抗病毒治疗疗效的关系:最后通过小鼠细胞免疫过继实验阐明 CXCR5+CD8+T细胞在肝内发挥抗病毒作用的免疫机制。 方法： 在健康志愿者(HCs)、慢性 HBV感染患者横向人群和临床抗病毒治疗纵向队列中，利用流式细胞术、酶联免疫实验、时～A测序等方法检测 CXCR5+CD8+T细胞的表型与功能特点，利用体外共培养实验检测其对 HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。接着利用 HBV感染者的肝癌(HCC)标本分析肝内 CXCR5+CD8+T细胞的特点。另外，我们还通过检测抗病毒治疗纵向队列以及停药队列患者血清 CXCL13的水平，并分析其与患者预后的关系，明确CXCL13趋化CXCR5+CD扩T细胞到肝内发挥抗病毒的分子机制。然后，我们利用高压尾静脉注射法(HDI)注射 pAAV-HBV1.2质粒建立 HBV感染小鼠模型，并利用 IL-21受体基因敲除 CIL-21RKO)小鼠和 B细胞缺陷型(μMT)小鼠，检测 CXCR5+CO8+T细胞在外周血、肝和脾脏中的表型与功能差异，以及探索IL-21R信号通路和 B细胞对 CXCRγCO8+T细胞功能的影响。最后通过 CXCR5+CD8+T细胞过继免实验，明确 CXCR5+CO8+T细胞的抗病毒作用。 结果： 1.慢性 HBV感染患者 CXCRS+CD们细胞中的特点 1.1 HBV感染患者与 HBsAg loss(慢性 HBV感染患者 HBsAg清除)患者CXCRγCD8+T细胞频数显著高于HCs，且 HBsAg loss患者 CXCR5+CD8+T细胞频数也高于 HBV组。 1.2 相比于 CXCRS-CD8+T细胞，CXCR5+CD8+T细胞上 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CD38、CD69、CCR7、CD45RO、CD62L表达更高，分泌干扰素(IFN)-γ、IL-2、IL-4、IL-17和 IL引能力更增强，但分泌granzyme B能力降低。 1.3 我们通过收集 HBV感染的肝癌患者肝内淋巴细胞与外周血单个核细胞(PBMC)，发现肝内 CXCR5+CD8+T细胞表达更高的 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CO38、CD69、HLA-DR和 CCR2等趋化因子受体。且肝内CXCR5+CD8+T细胞分泌 IFN-γ能力比外周血 CXCR5+CD8+T细胞强。通过五聚体标记 HBV C18-27肤特异性 CD8+T细胞时，我们发现肝内 HBV特异性 CXCR5+CO8+T细胞中的比例显著高于外周血。 2.外周血 CXCRS+CD8+T细胞与 CXCL13表达预测替比夫定抗病毒治疗疗效 2.1 我们通过检测替比夫定抗病毒治疗队列患者 PBMC中 CXCR5+CD8+T细胞的动态改变，结果发现52周完全应答的患者(CR组〉基线和第12周外周血 CXCR5+CD8+T细胞频数升高，且该细胞亚群分泌IFN-γ能力在基线和第24周也显著升高。 2.2 抗病毒治疗基线和治疗第12周外周血 CXCR5+CD8+T细胞频数与第52周时 HBV DNA水平呈显著负相关。 2.3 通过替比夫定抗病毒治疗纵向队列血清检测，发现在抗病毒治疗的基线、第12周和第52周时间点，完全应答(CR)组患者血清 CXCL13水平显著高于非完全应答(NCR)组。抗病毒治疗停药后，未复发组患者血清 CXCL13水平也显著高于复发组。而我们利用 HBV感染患者肝穿标本，发现肝内 CXCL13mRNA表达水平与外周血 CXCL13水平呈正相关。 3. CXCRS+CD8+T细胞通过分泌 IFN-γ和辅助 B细胞产生抗体控制 HBV感染 3.1 分选外用血 CXCR5+CD8+T细胞和 CXCR5-CD8+T细胞，体外使用 anti--CD3/CD28刺激，结果发现，相比于 CXCRS-CD8+T细胞培养组，CXCR5+CD8+T细胞的培养上清中 IFN-γ分泌升高，而 granzymeB分泌减弱。利用培养上清刺激HepG2.2.15细胞后，我们发现 CXCRS+CD8+T细胞组中 HBsAg和 HBeAg表达量降低更显著，而对 HepG2.2.1S细胞的杀伤作用更弱。 3.2 分选 CXCRS+CD8+T细胞和 CXCR5-CD8+T细胞后分别与 B细胞共培养，结果发现 CXCRS+CD8+T细胞的共培养体系中，分泌 HBcAb的 B细胞频数增加。 4. HBV感染小鼠模型中 CXCRS+CD8+T细胞的特点及对病毒控制的作用 4.1 通过注射 pAAV-HBVl.2质粒建立 HBV感染小鼠模型，我们发现 HBV感染小鼠脾脏和肝内 CXCRS+CD8+T细胞频数均高于外周血。与 CXCR5-CD8+T细胞相比，CXCRS+CD8+T细胞上高表达 PD-1、CCR7、CD62L和 ICOS等受体。 4.2 分离肝、脾淋巴细胞后，通过 anti-CD3/anti-CD28刺激，我们发现脾脏和肝脏的 CXCRS+CD8+T细胞分泌 IFN-γ和 IL-21能力显著强于 CXCRS-CD8+T细胞。而肝内 CXCRS+CD8+T细胞分泌 IFN-γ能力强于脾脏。 4.3 我们分选 CXCRS+CD8+T细胞和 CXCRS-CD8+T细胞，通过尾静脉过继免疫到 HBV感染小鼠上，发现过继转移24h和48h时可以在肝脏内检测到到较高的 CXCRS+CD8+T细胞频数。而且接受了 CXCRS+CD8+T细胞的小鼠血清HBsAg水平显著降低，且可以检测到相对更高水平的 HBcAb。 5.影响 CXCRS+CD8+T细胞的抗病毒作用的分子机制 5.1 HBV相关性 HCC患者肝脏和外周血 CXCR5+CD8+T细胞的 IL-21R表达较 CXCR5-CD8+T细胞的高，且其在肝脏内表达也显著高于外周血。 5.2 体外实验使用 PD-1或TIM-3抑制性抗体以及 IL-21刺激均可以使CXCR5+CD8+T细胞分泌 IFN-y增加，而 IL-21联合免疫检查点抑制剂作用更强。 5.3 在IL-2IR- KO小鼠上建立 HBV感染小鼠模型，结果发现IL-21R-KO小鼠和 WT小鼠肝脏、脾脏或外周血 CXCR5+CD8+T细胞频数无差异，但 IL-21RKO小鼠肝内和外周血 CXCRS+CD8+T细胞 IFN-y的能力下降。 5.4 在μMT小鼠上建立 HBV模型，结果发现μMT小鼠肝脏和脾脏CXCR5+CD8+T细胞频数较 WT小鼠显著降低，同时肝内和外周血CXCR5+CD8+T细胞分泌 IFN-γ的能力下降。 结论： CXCR5+CD8+T细胞频数和其 IFN-y分泌功能与慢性 HBV感染者的替比夫定抗病毒治疗应答相关。CXCR5+CD8+T细胞可以通过 IFN-y分泌以及辅助 B细胞分泌抗体，发挥抗病毒作用。慢性 HBV感染者肝炎活动时CXCL13表达升高，有助于趋化 CXCR5+CD8+T细胞到肝内从而控制 HBV。虽然 CXCR5+CD8+T细胞呈现部分耗竭状态，但是体外和动物实验表明，IL-21可以显著增强其抗病毒功能。
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