摘要
肾结石是临床上常见的肾脏疾病之一，75%的结石为草酸钙结石。国内的流行病学统计显示肾结石的发病率约为10%-15%，近几年来发病率呈全球性上升趋势。严重的肾结石可进展为慢性肾脏病(CKD)、终末期肾脏病(ESRD)，给社会和家庭带来沉重的经济和心理负担。随着现代医学和生物学研究的快速发展，利用全外显子组测序技术，目前已从肾结石患者中鉴定出了30多个疾病相关基因。但是由于缺乏好的动物模型，这些基因是否为真正的致病基因，以及他们的致病分子机制仍不明确。在本论文研究中，我们首先利用UAS-RNAi/Gal4系统建立了遗传性草酸钙肾结石果蝇模型，然后利用果蝇肾结石模型系统性的研究了目前已知的30多个肾结石相关基因的致结石作用及其潜在的分子机制。利用我们建立的果蝇草酸钙肾结石模型，我们进一步发现藤黄果提取物在体内可以明显抑制果蝇马氏管内结石的形成。同时，藤黄果提取物(GCE)在体内也可以高效的溶解果蝇马氏管内草酸钙结石。最后，我们的体外实验证实藤黄果提取物的主要成分羟基柠檬酸(HCA)可以迅速完全溶解果蝇马氏管内的草酸钙结石。我们的研究结果表明：果蝇肾结石模型是用来筛选肾结石致病新基因和溶石新物的理想模型；藤黄果提取物作为潜在的溶石药物，在草酸钙肾结石的临床治疗中有着光明的前景。 1．遗传性草酸钙肾结石果蝇模型的建立 目的：构建遗传性革酸钙肾结石果蝇模型，确立利用果蝇研究遗传性肾结石的可行性。 方法：利用UAS-RNAi/Uro-Gal4系统将vha55和vha100-2基因特异性的在果蝇马氏管主细胞内敲低后，检测vha55和vhal00-2对马氏管内草酸钙结石形成的影响。 结果：vha55和vhal00-2基因在果蝇马氏管主细胞内敲低后，显著促进马氏管内草酸钙结石的形成。 小结：利用UAS-RNAi/Uro-Gal4系统可以用来研究遗传性肾结石致病基因的功能。 2．利用果蝇肾结石模型系统研究肾结石相关基因的功能，并初步探究其影响结石肾结石形成的分子机制 目的：系统研究肾结石相关基因的功能，并初步探究其影响肾结石形成的分子机制 方法：(1)首先利用生物信息学方法，从果蝇基因信息库中找出目前已发现的30个肾结石相关基因的果蝇同源基因，利用UAS-RNAi/Uro-Gal4系统将这些基因特异性的在果蝇马氏管主细胞内敲低，再将这些果蝇喂养在含草酸钠的果蝇培养基中，1周后在解剖镜下将马氏管解剖，偏振光显微镜下观察马氏管内结石形成情况：(2)将基因敲低果蝇与野生型果蝇加入PBS后碾碎后，取上清，利用草酸根检测试剂盒，检测草酸根的离子浓度。 结果：目前己知的30个肾结石基因，80%的基因在马氏管主细胞内特异性敲低后，结石形成明显增加：基因敲低果蝇体内的草酸根离子普遍比野生型果蝇高。 小结：可以利用果蝇草酸钙肾结石模型，在体内对从结石病人中鉴定出的肾结石形成相关基因进行功能分析。这些基因是通过影响草酸的代谢和分泌，进而影响肾结石的形成。 3．探究藤黄果提取物对草酸钙肾结石的治疗作用及其分子作用机制 目的：利用体内和体外果蝇草酸钙肾结石模型，探究藤黄果提取物对草酸钙肾结石的治疗作用和它的分子作用机制。 方法：(1)将野生型雌性果蝇分别放于含有1%草酸钠和不同浓度GCE的果蝇培养基中，置于25℃、50%湿度、12h昼夜交替光照培养箱内培养一周，解剖分离出三期幼虫的马氏小管，在偏振光显微镜下观察马氏小管内结石的形成情况；(2)将出生3天的雌性果蝇分别放于含有0.1%草酸钠和不同浓度GCE果蝇培养基中，置于25℃、50%湿度、12h昼夜交替光照培养箱内，1周后解剖分离出马氏管，在偏振光显微镜下观察马氏管内结石的形成情况：(3)将出生3天的雌性果蝇放入含有0.3%草酸钠果蝇培养基中培养1周，使果蝇马氏管内形成大量结石，再将这果蝇放入含有0.1%草酸钠和不同GCE的果蝇培养基中，分别在第4d、7d解剖分离出马氏管，在偏振光显微镜下观察结石的形成情况；(4)将出生3天的野生型雌性果蝇放于含有0.3%草酸钠果蝇食物中，1周后解剖分离马氏管，将分离出的马氏管放入含有不同浓度羟基柠檬酸的水溶液中，在偏振光显微镜下实时动态观察马氏管内结石的变化情况。根据不同药物处理后，结石的形成面积或者溶解后剩余面积，计算出藤黄果提取物对草酸钙结石的形成或者结石溶解的影响。 结果：藤黄果提取物有效抑制果蝇幼虫和成虫马氏管内草酸钙结石的形成；藤黄果提取物高效溶解果蝇成虫马氏管内的草酸钙结石：羟基柠檬酸在体外高效的直接溶解马氏管内草酸钙结石。 小结：体内实验证实藤黄果提取物通过直接溶解马氏管内的草酸钙结石，进而抑制结石的形成：体外试验的结果表明藤黄果提取物通过其有效成分羟基柠檬酸溶解草酸钙结石。
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