摘要
番茄白粉病作为世界性的真菌病害，对于番茄生产的危害性逐年加重。MLO基因家族作为对白粉病菌重要的感病因子，在植物中对白粉病菌抗性具有重要的负调控作用。前期研究结果显示番茄SlMLO2、SlMLO4基因密切参与白粉菌胁迫应答，但相关的功能与机制尚不明晰。因此本研究对SlMLO2、SlMLO4基因开展相关生物信息学分析，以感病品种Moneymaker(MM)为试验材料，克隆SlMLO2和SlMLO4基因，通过实时荧光定量PCR分析这两基因在根、茎、叶、花、绿果、转色果和红果共7个组织中的表达量以及SlMLO4基因受白粉菌诱导后不同时间段的表达谱研究;基于pCAMBIA2300-GFP载体构建SlMLO2、SlMLO4基因过量表达载体，并瞬时转化本氏烟草进行亚细胞定位分析以及农杆菌介导的本氏烟草、感病番茄品种MM和抗病品种62579、62794的遗传转化:基于CRISPR-Cas9技术构建SlMLO4基因敲除载体，转化MM。主要研究结果如下: 1、多序列比对显示SlMLO2、SlMLO4蛋白及同源序列间均具有6个保守结构域:系统进化显示与SlMLOs家族同源性最高的序列多数为茄科植物:蛋白质理化性质预测显示SlMLO2蛋白质分子量为57459.05Da，理论等电点为9.01，包含6个跨膜螺旋:SlMLO4蛋白质分子量为62562.53Da,理论等电点为8.47,包含7个跨膜螺旋;亚细胞定位预测结果显示SlMLO2和SlMLO4蛋白质均定位在细胞膜上。 2、克隆载体测序结果显示SlMLO2、SlMLO4基因均与NCBI已提交序列保持一致。SlMLO2基因全长序列为1515bp,编码504个氨基酸;SlMLO4基因全长序列为1659bp，编码552个氨基酸。 3、组织特异性研究显示，以转色果的表达量为对照，SlMLO4基因在茎、花、根、叶、绿果和红果中的表达量依次约为转色果的36倍、28倍、22倍、9倍、2.5倍和1.5倍:以茎的表达量为对照，SlMLO2毕因在红果、花、转色果、根、叶和绿果中的表达量依次的为茎的3倍、3倍、2.9倍、1.8倍、1.4倍和1.4倍。 4、SlMLO4基因受白粉菌诱导后的表达量研究显示，白粉菌接种后0h-12h.SlMLO4基因表达量呈现上调趋势:白粉菌按种后3h表达量与0h的相比无明显变化，接种后6h和12h的表达量约为0h的3倍和10倍。 5、质粒测序结果证明，成功构建SlMLO2、SlMLO4基因过量表达软体和SlMLO4基因编辑载体。 6.通过瞬时转化本氏烟草，亚细胞定位结果显示，pCAMBIA2300-SMLO4定位在细胞膜上，pCAMBIA2300-SlMLO2定位在细胞膜和细胞核膜上。 7、已获得pCAMBIA2300-SlMLO4，pCAMBIA2300-SlMLO2及pCAMBIA2300-GFP在本氏烟草和番茄(MM、62579、62794)中的再生植株，SlMLO4基因编辑载体转化MM番茄处于生相期。转化效率结果显示MM和62579的转化效率明显高于62794的转化效率。
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