摘要
胶质瘤作为中枢神经系统最常见原发性肿瘤，约占中枢神经系统原发性肿瘤的70％，依据WHO分类胶质瘤可分为四个级别，其中Ⅰ/Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ/Ⅳ级为高级别胶质瘤。多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiform,GBM）作为胶质瘤中恶性程度最高的Ⅳ级肿瘤，患者预后极差，尽管美国癌症医学网络(NCCN)推荐术后放疗联合同步和辅助替莫唑胺(Temozolomid，TMZ)化疗（Stupp方案）作为治疗GBM的标准方案，但也仅提高患者2个月的总体生存期。研究表明TMZ是以诱导细胞自噬的方式，针对GBM发挥化疗作用。 前期研究证实:TMZ作用下，部分自噬细胞短期存活，并伴随EMT发生，促进存活细胞迁移和侵袭，介导放化疗抗性。本研究通过诱导GBM细胞自噬发现泛素连接酶HERC3上调并泛素化降解SMAD7，从而激活TGF-β通路，最终诱导GBM细胞EMT发生，为洞察了解GBM的放化疗抵抗提供新的视角。 第一章 自噬条件下胶质母细胞瘤细胞相关蛋白组学分析 方法:用浓度为200nM Rapamycin分别处理U87MG细胞6h、8h、12h、24h、48h，而后进行同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白组学分析。 结果:iTRAQ蛋白组学分析证实，伴随细胞进入自噬状态，泛素连接酶HERC3，以及TGF-β通路重要蛋白SMAD3、PAI1表达明显上调，而SMAD7下调。 第二章 HERC3对GBM预后的影响 方法:利用免疫组织化学染色及western blot检测胶质瘤组织芯片、肿瘤标本以及5对GBM原代细胞株HERC3的蛋白量。进一步通过癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)的数据以及南方医院神经外科所采集的110例GBM患者随访资料进行生存分析，研究HERC3与GBM患者预后的相关性。 结果:HERC3表达与GBM的恶性程度正相关，且与GBM细胞的侵袭性正相关。 第三章 HERC3在胶质母细胞瘤中的生物学作用 方法:TMZ、LG、Rapa处理GBM细胞不同时间段后，Westem blot及免疫荧光验证HERC3表达情况，并依据上述结果在HERC3表达高峰通过免疫细胞化学染色研究其表达量及形态变化。抑制细胞自噬水平后，Westem blot验证HERC3及TGF-β通路激活相关蛋白表达。在两个不同HERC3表达背景的细胞（LN229高表达HERC3，T98G低表达HERC3）中，利用慢病毒分别干扰和过表达HERC3后，采用Western blot、划痕迁移实验、Transwell小室侵袭实验检测细胞生物学、表型改变及TGF-β通路激活情况。 结果:TMZ、LG、Rapa处理GBM细胞后，随作用时间延长HERC3表达量逐渐上升，于12-16小时左右达高峰，与iTRAQ蛋白质组学分析结果一致，免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示，HERC3表达明显上调且入核增多，细胞纤细且触手增长。细胞自噬水平受抑后，HERC3表达及TGF-β通路受抑。LN229稳定干扰HERC3后，SMAD7表达上调，而TGF-β通路及细胞迁移和侵袭能力受抑。T98G稳定过表达HERC3后，SMAD7表达下调，而TGF-β通路激活，细胞迁移和侵袭能力增强。 第四章 HERC3介导TGF-β通路激活 方法:构建SBE荧光素酶报告基因质粒，合成TGF-β通路下游PAI1及NOTCH1引物，采用荧光素酶报告基因及QRT-PCR检测HERC3对TGF-β通路的作用，并通过Westem blot检测HERC3在蛋白水平对TGF-β通路的影响。 结果:荧光素酶报告基因、QRT-PCR、Westem blot等实验均证实，HERC3可上调TGF-β通路下游靶基因PAI1及NOTCH1表达，并介导胶质瘤细胞发生EMT。 第五章 HERC3诱导SMAD7泛素化并通过自噬溶酶体降解 方法:构建Myc-HERC3，Flag-SMAD7，HA-Ub过表达质粒，利用放线菌酮(CHX)干扰蛋白合成，Westem blot检测Flag-SMAD7表达水平，并免疫共沉淀检测HERC3对内、外源性SMAD7泛素化水平的影响。梯度过表达Myc-HERC3，Westem blot检测Flag-SMAD7表达水平。自噬抑制剂3-MA，氯喹(CQ)及蛋白酶体抑制剂MG132处理Rapamycin诱导后的LN229细胞，Western blot检测SMAD7表达水平。 结果:Flag-SMAD7表达量的下调表现出对HERC3及泛素的依赖性，IP证实内、外源性过表达HERC3后SMAD7泛素化水平增高。提示HERC3作为泛素连接酶介导了SMAD7的泛素化降解。自噬抑制剂3-MA和氯喹(CQ)能逆转Rapamycin所诱导的SMAD7下调，而MG132（蛋白酶体抑制剂）不能。提示:HERC3诱导SMAD7泛素化降解，并通过自噬溶酶体降解而非蛋白酶体。
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