摘要
A族链球菌(group A streptococcus, GAS )是最常见的致病菌之一，其可以依赖于自身的结构蛋白(如：M蛋白，FbaA蛋白等)和分泌蛋白(如：链球菌溶血素O，链球菌热原外毒素B等)侵入上皮或内皮细胞，对宿主构成威胁。但是，宿主细胞与病原体的博弈中，可以通过自噬清除病原体。自噬目前被认为是非吞噬细胞清除病原体的最有效途径。 自噬是高度保守的细胞分解代谢过程，在细胞稳态中起关键作用，响应各种环境压力，例如饥饿，缺氧，氧化应激和辐射等，都可以显著诱导自噬。自噬发生过程涉及形成双层膜的囊泡，被称为自噬小体。自噬小体本身不具有降解功能，但是其内的各种内容物，将随着自噬小体与溶酶体结合而进行降解，产生的营养物质将被回收并参与新物质的合成或能量的生成。基础自噬通过持续去除受损的细胞器，蛋白质聚集体和长寿命蛋白维持正常的机体稳态。除此之外，当许多病原菌包括沙门氏菌，志贺氏菌，李斯特菌，军团菌，分枝杆菌，弗朗西斯菌等侵入宿主细胞中时，也能引发自噬反应的发生，靶向入侵的病原菌，这一过程被称为异体自噬。越来越多的研究表明，异体自噬作为细胞内先天免疫的关键机制，其可以控制许多外来微生物的命运，包括细菌，病毒以及寄生虫。 鉴于异体自噬在细胞先天防御中的普遍作用，该过程的一个关键点是依赖于宿主细胞对入侵细菌的感知，从而引发自噬反应。哺乳动物细胞能够表达多种细胞表面或细胞溶质中的模式识别受体(PRR)，如Toll样受体(TLRs)或NOD样受体(NLRs)，它们可以识别特定的病原相关分子模式(PAMP)，例如革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)或肽聚糖(PG)。目前许多研究已经证实了TLRs或NLRs与自噬诱导之间存在联系，如LPS通过TLR4参与吞噬细胞中的自噬；单链RNA通过TLR7激活诱导抗分枝杆菌的自噬；检测细菌肽聚糖的细胞溶质受体NOD1和NOD2将ATG16L募集到弗氏志贺氏菌上从而启动自噬。病原菌除了与上述受体相互识别外，整合素家族受体也是一类重要的宿主细胞表面受体，几乎在所有细胞中都有分布，在病原菌粘附，侵入宿主细胞中起到重要作用。 在我们研究中发现，GAS感染Hep2细胞诱导的自噬，与已有较多报道的Toll样受体无关，而与整合素家族受体密切关联。整合素α5β1通过与GAS的结构蛋白FbaA相互识别进而启动自噬。并且我们对其机制进行了深入探讨。关于病原菌，整合素受体和自噬发生之间的分子联系鲜有报道，整合素受体是否可以作为宿主细胞受到病原菌感染时启动自噬、保护宿主细胞的一般事件？这将进一步丰富病原菌和宿主相互作用的模式，为发现新的抗菌策略和为自噬靶向治疗的药物的研发提供了理论基础。 第一部分呼吸道上皮细胞通过自噬清除A族链球菌 目的：通过体内外实验检测M1GAS(致病性最广的GAS血清型)感染呼吸道上皮细胞后，细胞内的细菌生存量以及自噬活性的变化；探讨自噬与M1GAS之间的关系。 方法： 1M1GAS(感染复数为MOI=100)感染Hep2细胞(培养基内不含抗生素)。感染2h后，使用含有10倍浓度的抗生素的培养基杀灭细胞外M1GAS。继续培养细胞，在感染M1GAS后的5h，10h及25h时，破碎细胞，在血琼脂平板上进行活细菌培养。计数不同时间点细胞内的活细菌数量。 2自噬对细胞内的M1GAS的影响。 2.1构建针对Atg5(自噬体形成的必须蛋白)的sh-RNA干扰质粒，利用慢病毒将sh-Atg5的质粒转入Hep2细胞内，利用Westernblot技术检测Atg5蛋白的表达情况，筛选出Atg5被干扰的Hep2稳定细胞株。 2.2用M1GAS感染Hep2细胞和Hep2-sh-Atg5细胞，感染2h后，使用含有10倍浓度的抗生素的培养基杀灭细胞外M1GAS。继续培养细胞，在感染M1GAS6h后，破碎细胞，在血琼脂平板上进行活细菌培养。计数同一时间点上，Hep2细胞和Hep2-sh-Atg5细胞胞内的活细菌数量。 3M1GAS对Hep2细胞内自噬形成的影响。 3.1M1GAS感染Hep2细胞，在感染分别为0h，2h，4h，6h后，收集细胞，提取全细胞蛋白。利用Westernblot技术检测表达LC3蛋白(自噬的标志性蛋白)的变化水平。确定M1GAS诱导自噬的时间变化。 3.2利用转染试剂Lipofectamine2000将pBABE-puro-EGFP-LC3的质粒转染到Hep2细胞中。转染24h后，用M1GAS感染，6h后，用共聚焦显微镜观察EGFP-LC3在细胞中的分布情况。 3.3M1GAS感染Hep2细胞，6h后，收集细胞，用2.5%戊二醛固定细胞，利用透射电镜观察自噬小体的结构。 4小鼠体内实验证明M1GAS与自噬的相互影响。 4.1用M1GAS(3×108CFU/50μl)鼻滴小鼠，感染24h后，取小鼠的肺组织(全程操作保持无菌环境)。Westernblot检测肺部LC3蛋白的表达情况，血琼脂平板进行活菌培养，检测小鼠肺部M1GAS的生存量。 4.2构建Atg5(KO)缺陷小鼠，通过Westernblot检测肺部Atg5蛋白的表达情况，确定Atg5(KO)缺陷小鼠是否构建成功。然后用M1GAS感染WT健康小鼠和Atg5(KO)缺陷小鼠，24h后，取肺组织，行血琼脂平板培养活菌。比较WT健康小鼠和Atg5(KO)缺陷小鼠肺部活菌的生存量。 5热灭活的M1GAS诱导自噬的情况。 5.1将M1GAS经过70℃热灭活1h，收集热灭活的细菌。然后，感染Hep2细胞(感染复数为MOI=100)。在感染的0h，2h，4h和6h的时间点，分别收取细胞，提取全细胞蛋白。通过Westernblot技术分析LC3的表达变化。 5.2利用转染试剂Lipofectamine2000将pBABE-puro-EGFP-LC3的质粒转染到Hep2细胞中。转染24h后，用热灭活的M1GAS感染Hep2细胞，6h后，用共聚焦显微镜观察EGFP-LC3在细胞中的分布情况。 6缺陷M蛋白或者FbaA蛋白的M1GAS菌株对自噬的影响。 6.1WTM1GAS，FbaA-M1GAS和M-M1GAS分别感染Hep2细胞，在感染6h后，收集细胞，提取全细胞蛋白。利用Westernblot技术检测LC3蛋白的表达变化水平。 6.2将质粒pBABE-puro-EGFP-LC3转染到Hep2细胞内。转染24h后，用WTM1GAS，FbaA-M1GAS和M-M1GAS分别感染Hep2细胞，感染6h后，用共聚焦显微镜观察Hep2细胞质中EGFP-LC3的聚集情况。6.3WTM1GAS，FbaA-M1GAS和M-M1GAS分别感染Hep2细胞，在感染6h后，收集细胞，破碎细胞，在血琼脂平板上进行活菌培养。计数三种细菌在细胞内的存活情况。 7M1GAS菌体蛋白FbaA和M对自噬的影响。 7.1用不同浓度(0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml)的FbaA蛋白和M蛋白刺激Hep2细胞。通过检测LC3蛋白的表达水平，来确定最佳刺激浓度。 7.2使用最佳浓度(30μg/ml)的FbaA蛋白和M蛋白刺激Hep2细胞，通过Westernblot检测LC3蛋白，P62蛋白的变化。 7.3分别使用PBS，纯化的FbaA蛋白，FbaA蛋白+3-MA(自噬抑制剂3-甲基腺苷，10mM)预处理细胞30min。然后，使用M1GAS感染Hep2细胞，6h后，收取细胞，破碎细胞，在血琼脂平板上进行活细菌培养。24h后计数细菌数量。 8FbaA蛋白分段表达，确定诱导自噬的有效片段。 8.1根据本实验室以前研究，确定出FbaA蛋白的功能片段并分别表达纯化。四段片段分别为A(aa#37-110)，B(aa#68-161)，C(aa#104-277)，D(aa#160-324)。 8.2分别使用上述四段FbaA蛋白片段，以浓度为30μg/ml刺激Hep2细胞，分别在0h，2h，4h，6h时间点处，收集细胞。利用Westernblot检测LC3蛋白的变化。 8.3分别使用上述四段FbaA蛋白片段，以浓度为30μg/ml刺激转染pBABE-puro-EGFP-LC3质粒的Hep2细胞，使用共聚焦显微镜观察EGFP-LC3的分布情况。 结果： 1用M1GAS感染Hep-2细胞后，于不同时间点破碎裂解细胞，并且进行活细菌培养。结果显示随着时间的延长，细胞内的活细菌数量逐渐减少，在25h后几乎检测不到M1GAS的存在。 2自噬有利于Hep2细胞清除入侵的M1GAS。 2.1通过Westernblot实验，Atg5蛋白相对于正常细胞株来说，几乎不表达。确定Atg5缺陷的Hep2稳定细胞株构建成功。 2.2通过活细菌计数，M1GAS感染的Hep2-sh-Atg5细胞胞内的活细菌数量远高于Hep2细胞(P＜0.05)。 3M1GAS成功诱导Hep2细胞的自噬发生。 3.1M1GAS感染Hep2细胞后，LC3Ⅱ蛋白在4h时，开始高表达(P＜0.05)，一直到6h仍然升高。 3.2M1GAS的感染导致了Hep2细胞内的EGFP-LC3蛋白的分布发生变化，从细胞质中均匀分布变为点状聚集分布。 3.3M1GAS感染Hep2细胞，固定后，经过透射电镜观察。结果显示：Hep2细胞胞浆内形成大量具有双层膜结构的囊泡(自噬小体)，并且其内含有明显的M1GAS存在。 4M1GAS成功诱导小鼠肺部自噬发生，并且自噬有利于M1GAS在小鼠肺部的清除。 4.1M1GAS滴鼻感染小鼠后，取其肺部匀浆。Westernblot的结果显示：与PBS组相比较，LC3Ⅱ蛋白明显升高。 4.2经过Westernblot检测，Atg5缺陷小鼠构建成功。M1GAS感染Atg5缺陷小鼠，其肺部生存的活菌量明显高于WT健康小鼠(P＜0.05)。 5热灭活的M1GAS能够诱导自噬的发生。 5.1热灭活的M1GAS刺激Hep2细胞，Westernblot结果显示：LC3Ⅱ蛋白的表达随着时间而升高。 5.2共聚焦显微镜下观察到，热灭活的M1GAS刺激使Hep2细胞内的EGFP-LC3蛋白从胞质内的均匀分布变成点状聚集分布。 6WTM1GAS和M-M1GAS比FbaA-M1GAS诱导更高水平的自噬。 6.1被三株菌感染后，Westernblot结果显示：与FbaA-M1GAS相比，WTM1GAS和M-M1GAS刺激引起更高的LC3Ⅱ蛋白表达(P＜0.05)。 6.2被三株菌感染后，共聚焦显微镜结果显示：WTM1GAS和M-M1GAS刺激引起EGFP-LC3蛋白的点状分布。 6.3被三株菌感染后，活细菌计数的结果显示：FbaA-M1GAS在Hep2细胞内的生存量更高。 7M1GAS菌体蛋白FbaA成功诱导完整的自噬流反应，而M蛋白不能诱导自噬的发生。 7.1用不同浓度的FbaA蛋白和M蛋白刺激Hep2细胞后，Westernblot结果显示：当FbaA蛋白浓度为30μg/ml时，LC3Ⅱ蛋白表达最高。而M蛋白不论剂量多少，都不能引起LC3Ⅱ蛋白表达的变化。 7.2使用最佳浓度(30μg/ml)的FbaA蛋白和M蛋白刺激Hep2细胞， Westernblot结果显示：只有FbaA蛋白引起P62蛋白的表达变化，且为逐渐降低的趋势(P＜0.05)。而M蛋白不能引起P62蛋白的变化。 7.3使用PBS，纯化的FbaA蛋白，FbaA蛋白+3-MA预处理细胞30min，对Hep2细胞内的活菌计数结果显示：FbaA蛋白处理组，胞内菌最少(P＜0.05)；FbaA蛋白+3-MA处理组，胞内菌最多(P＜0.05)。 8纯化的FbaA蛋白片段中，只有B(aa#68-161)片段成功诱导自噬发生。 8.1四段FbaA蛋白片段刺激细胞后，Westernblot结果显示：只有B(aa#68-161)片段引起了LC3Ⅱ的高表达。 8.2四段FbaA蛋白片段刺激细胞后，共聚焦显微镜结果显示：只有B(aa#68-161)片段引起了Hep2细胞内EGFP-LC3蛋白的点状分布。 小结： 1M1GAS进入Hep2细胞10小时后被清除。 2M1GAS可以诱导Hep2细胞发生自噬，自噬有利于清除入胞的M1GAS。 3M1GAS的菌体蛋白FbaA是诱导自噬的有效蛋白，并且FbaA蛋白的第68-161氨基酸序列为诱导自噬的肽段。 第二部分FbaA蛋白由Fn介导结合上皮细胞整合素α5β1受体启动自噬及其机制的研究 目的：利用分子生物学手段，检测FbaA蛋白通过宿主细胞的何种分子启动自噬以及该过程中涉及的信号通路。 方法： 1分析TLR2和TLR4受体蛋白是否参与FbaA诱导自噬的过程。 1.1利用纯化的FbaA蛋白刺激Hep2细胞，收集不同时间点(0h，2h， 4h，6h)的细胞，提取蛋白。检测TLR2和TLR4的蛋白表达变化情况。 1.2利用通过HiPerFect转染试剂，将小干扰RNA(si-control ， si-TLR2,si-TLR4)分别转染到Hep2细胞内。转染36h后，通过Westernblot检测干扰水平以及对LC3Ⅱ蛋白表达的影响。 2通过Pulldown实验技术，分别检测FbaA和FbaA+Fn与整合素α5β1的结合情况。 3使用低浓度(10μg/ml)和高浓度(40μg/ml)的FbaA蛋白刺激Hep2细胞，检测细胞的Fn蛋白和整合素α5β1受体蛋白的表达变化情况。 4以不同浓度(0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml)的Fn蛋白刺激Hep2细胞。另一组实验中，不仅加入不同浓度的Fn蛋白，而且还要一起加入FbaA蛋白。检测LC3Ⅱ蛋白的表达变化情况。 5将小干扰RNA(si-Control，si-Fn，si-Integrinα5，si-Integrinβ1)转染到Hep2细胞中。36h后，加入FbaA蛋白刺激6h，收集细胞，提取全细胞蛋白，检测Fn蛋白，Integrinα5蛋白，Integrinβ1蛋白以及LC3Ⅱ蛋白的表达变化。 6分别将Fn蛋白，Integrinα5蛋白以及Integrinβ1蛋白通过小干扰RNA敲低后，使用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin，100nM)预处理si-Control细胞，si-Fn细胞，si-Integrinα5细胞，si-Integrinβ1细胞。然后加入M1GAS感染这四种细胞，6h后，收集细胞，破碎细胞，在血琼脂板上进行活菌培养，计数相应细胞内的活菌数量。 7FbaA蛋白刺激Hep2细胞6h后，收集细胞，提取全细胞蛋白。检测mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1，Beclin-1，p-Beclin-1蛋白的表达变化。 8通过小干扰RNA手段，分别将Hep2细胞中的Fn蛋白，Integrinα5蛋白以及Integrinβ1蛋白敲低后，再用FbaA蛋白刺激。检测各处理组中mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1，Beclin-1，p-Beclin-1蛋白的表达变化。 9通过免疫共沉淀的方法检测不同条件下(Control组，FbaA组，si-Fn+FbaA组，si-Integrinα5+FbaA组，si-Integrinβ1+FbaA组)Vps34，Beclin-1，Rab7之间的相互作用。 10构建Hep2-sh-Beclin-1稳转细胞株，使用Westernblot验证稳转效果。通过免疫共沉淀的方法检测Hep2细胞和Hep2-sh-Beclin-1稳转细胞中加入FbaA蛋白刺激后，Rab7和Vps34之间的相互作用。 结果： 1TLR2和TLR4受体蛋白不参与FbaA诱导自噬的过程。 1.1FbaA蛋白刺激Hep2细胞，Westernblot的结果显示：TLR2和TLR4蛋白表达水平不随着时间发生变化。 1.2通过小干扰RNA敲低Hep2细胞的TLR2和TLR4蛋白，检测结果显示：单独敲低TLR2和TLR4蛋白对LC3Ⅱ不产生影响，即使加入FbaA蛋白刺激也不引起LC3Ⅱ蛋白的变化。但是FbaA蛋白刺激组比未刺激组的LC3Ⅱ蛋白表达升高。 2Pulldown实验结果显示：单独的GST不能结合整合素α5β1；单独的GST-FbaA刺激，和整合素α5β1会有少量结合；GST-FbaA蛋白和Fn蛋白一起刺激时，比单独的GST-FbaA刺激会有更多的整合素α5β1结合。 3低浓度和高浓度的FbaA蛋白不能引起Fn蛋白和整合素α5β1受体蛋白的变化，但是高浓度的FbaA蛋白引起LC3Ⅱ蛋白的高表达。 4单独且不同剂量的Fn蛋白刺激，不能引起LC3Ⅱ蛋白的表达变化；但是当FbaA蛋白一起加入时，我们发现LC3Ⅱ蛋白表达升高且与Fn的浓度呈现剂量依赖关系。 5单独敲低Fn蛋白或Integrinα5蛋白或Integrinβ1蛋白时，与对照组相比，LC3Ⅱ蛋白的表达不发生变化；与未加FbaA蛋白刺激组相比，FbaA蛋白刺激组LC3Ⅱ表达升高；LC3Ⅱ表达在敲低组比未敲低组中要低(同时加入FbaA蛋白刺激)。 6活菌计数结果显示：si-Fn组，si-Integrinα5组，si-Integrinβ1组中的胞内菌数量比si-Control组高(P＜0.05)。Rapamycin处理组比相应组的胞内菌数量要低(P＜0.05)。 7FbaA蛋白刺激Hep2细胞后，Westernblot的结果显示：mTOR，ULK1和Beclin-1表达不随时间发生变化；但是p-mTOR和p-ULK1从2h开始表达开始降低，直到6h；p-Beclin-1从2h开始表达开始升高，直到6h。 8Westernblot的结果显示：单独敲低Fn蛋白或Integrinα5蛋白或Integrinβ1蛋白，不会对mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1，Beclin-1，p-Beclin-1蛋白的表达变化产生影响。加入FbaA蛋白刺激，si-Control组与si-Fn组或si-Integrinα5组或si-Integrinβ1组相比，p-mTOR，p-ULK1表达减低，p-Beclin-1表达升高。 9免疫共沉淀结果显示：FbaA蛋白刺激正常Hep2细胞，Vps34，Beclin-1，Rab7三者发生免疫共沉淀；但是当敲低Fn蛋白或Integrinα5蛋白或Integrinβ1蛋白时，再用FbaA蛋白刺激，，Vps34，Beclin-1，Rab7三者不能发生免疫共沉淀。 10Westernblot和免疫共沉淀结果显示：在Hep2-sh-Beclin-1稳转细胞株中，Rab7和Vps34之间不能发生结合。 小结： 1FbaA蛋白诱导自噬发生与TLR2和TLR4受体无关。 2FbaA蛋白结合Fn蛋白通过整合素α5β1受体启动自噬。 3FbaA蛋白通过胞内mTOR-ULK1-Belin-1信号通路，激活Vps34，招募Rab7启动自噬。 第三部分动物体内研究自噬对A族链球菌感染的影响以及分子机制 目的：利用健康小鼠和基因缺陷鼠研究M1GAS在体内启动自噬的机制以及自噬在体内产生的影响。 方法： 1使用WTM1GAS和FbaA-M1GAS分别感染健康小鼠，24h后，无菌取其肺组织。通过Westernblot检测肺部LC3Ⅱ蛋白的表达情况。通过血琼脂平板上计数肺部活菌数量。 2感染气囊模型：将健康小鼠麻醉后，用1ml空气皮下注射小鼠以形成气囊，然后用0.5mlPBS(含有3×108个WTM1GAS或者FbaA-M1GAS)接种。48h后，用ImageJ软件测量小鼠皮肤损伤区域。 3通过CRISPR-Cas9技术和腺相关病毒(AAV6)载体，将包含：sgRNA-Control，sgRNA-Integrinα5和sgRNA-Integrinβ1(1×1011vg/mice)的AAV6分别鼻滴健康小鼠，从而感染小鼠的肺部。3周后，取小鼠肺组织进行WB验证，构建Integrinα5和Integrinβ1蛋白敲低小鼠。 4M1GAS鼻滴感染(3×108CFU/50μl)健康WT小鼠，sgRNA-Integrinα5敲低鼠或sgRNA-Integrinβ1敲低鼠。24h后，无菌取其肺组织，匀浆。通过Westernblot检测肺部LC3Ⅱ蛋白的表达情况。活菌计数检测肺部活菌生存数量。 5通过H&E染色，镜下观察WTM1GAS和FbaA-M1GAS感染健康小鼠时，肺部炎症情况以及WTM1GAS感染Atg5(KO )鼠，sgRNA-Integrinα5敲低鼠和sgRNA-Integrinβ1敲低鼠时，肺部炎症情况。 结果： 1Westernblot结果显示：与WTM1GAS感染健康小鼠相比较，FbaA-M1GAS感染小鼠引起肺部LC3Ⅱ蛋白表达更低(P＜0.05)，但是肺部活菌生存量更高(P＜0.05)。 2通过测量小鼠皮肤损伤区域，用ImageJ软件分析：FbaA-M1GAS感染小鼠引起更大面积的皮肤损伤(P＜0.05)。 3Westernblot结果显示：sgRNA-Integrinα5敲低鼠和sgRNA-Integrinβ1敲低鼠诱导成功，其肺部Integrinα5蛋白或者Integrinβ1蛋白，几乎不表达甚至完全不表达(P＜0.05)。 4与健康WT小鼠相比，M1GAS感染sgRNA-Integrinα5敲低鼠和sgRNA-Integrinβ1敲低鼠诱导的LC3Ⅱ蛋白表达更低(P＜0.05)，但是肺部活菌生存量却比健康WT小鼠要更高(P＜0.05)。 5小鼠肺脏H&E染色结果显示：与PBS组相比，感染WTM1GAS或者FbaA-M1GAS的小鼠引发了严重的肺部炎症，具体表现为淋巴细胞浸润，肺泡间隔增厚。与健康WT小鼠感染WTGAS相比较，基因缺陷鼠Atg5(KO)、sgRNA-Integrinα5敲低鼠和sgRNA-Integrinβ1敲低鼠表现出更为明显的炎性细胞侵润，肺泡间隔严重增厚，肺泡里可见大量出血，炎症病变面积更大。 小结： 1M1GAS诱导小鼠肺部细胞发生自噬，且FbaA蛋白是主要蛋白。 2小鼠肺部整合素α5β1受体识别M1GAS从而启动自噬。 结论： 1M1GAS在上皮细胞中被清除与菌体蛋白FbaA诱导自噬发生相关，并且FbaA蛋白的第68-161氨基酸序列为诱导自噬的肽段。 2FbaA蛋白由Fn介导结合于上皮细胞整合素α5β1受体而启动自噬。 3FbaA蛋白诱导自噬的胞内信号：通过mTOR-ULK1-Beclin-1信号通路，激活Vps34从而招募Rab7启动自噬。 4在小鼠肺部，整合素α5β1受体通过识别M1GAS的菌体蛋白FbaA诱导自噬的发生，从而清除入侵的M1GAS。 5敲除自噬相关蛋白M1GAS感染可以引起小鼠更严重的炎症病变。
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