摘要
N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)参与介导革兰氏阴性菌间的通讯，是细菌群体感应(Quorum Sensing，QS)中常见的信号分子之一。有证据表明AHLs除了能被细菌感知，还参与调控植物细胞生长活动。本实验室前期已经证实GCR2参与细菌信号3OC6-HSL的传递过程，且能够特异性结合3OC6-HSL。那么GCR2蛋白在感知信号3OC6-HSL后通过什么方式传递信号的分子机制，目前尚不清楚。最近证实，在哺乳动物中与植物GCR2蛋白氨基酸序列高度同源的LanCL2是激素ABA的受体蛋白，其豆蔻酰化修饰使得LanCL2蛋白定位于质膜发生并核转质从而介导ABA信号的传递过程。我们发现在植物GCR2蛋白的氨基酸序列中含有潜在的豆蔻酰化位点，于是猜测GCR2蛋白在感知传递信号3OC6-HSL的过程中，其豆蔻酰化修饰可能发挥着重要作用。因此，探究GCR2蛋白豆蔻酰化修饰作用，解释GCR2感知传递细菌信号3OC6-HSL的分子机制是本文的研究重点。 本文从表型上分析，信号分子3OC6-HSL和豆蔻酰化抑制剂2-羟基十四烷酸(2-HydroxyMyristic Acid ， HMA )处理野生型Col-0拟南芥幼苗植株，结果显示3OC6-HSL和HMA互作后会抑制拟南芥的主根生长，表明豆蔻酰化作用参与信号感知传递过程。从分子生物学入手，通过构建重组表达载体Flexi-GCR2和Flexi-G2A豆蔻酰化位点突变的GCR2，利用TNT麦胚无细胞转录翻译系统分别掺杂加入35S-甲硫氨酸和[9,10-3H]-豆蔻酸合成GCR2和G2A蛋白。通过放射自显影分析发现合成GCR2和G2A蛋白，但未检测到豆蔻酰化修饰作用；利用豆蔻酸衍生物Alk14和3OC6-HSL处理GCR2过表达植株采用点击化学法检测进行豆蔻酰化状态，结果也未检测到蛋白的豆蔻酰化修饰作用。从遗传学角度分析，通过构建重组表达载体pBI121-GCR2-GFP和pBI121-G2A-GFP，获得农杆菌GV3101转化菌株。采用农杆菌介导浸花法侵染GCR2缺失型拟南芥突变植株gcr2-2，通过抗性筛选等手段，获得T0代转基因植株17株。 为补充说明前期N-癸酰高丝氨酸环内酯(N-decanoyl-HSL，C10-HSL)对拟南芥细胞内钙离子变化的影响，利用Fluo-4，AM荧光探针法和钙离子的不同抑制剂异搏定(VP)、EGTA、LiCl和LaCl3来探究钙离子的具体来源，结果显示，C10-HSL处理引起细胞内钙离子变化，且能够抑制拟南芥主根生长，加入抑制剂后主根抑制作用有所回复，LiCl回复作用明显，说明胞内钙离子释放参与C10-HSL信号的传递。
NETL