摘要
目的：利用ApoE3、ApoE4转基因小鼠制作原代神经元以建立阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型。分别检测神经元中沉默信息调节因子3(Sirtuin3，Sirt3)的表达量，以及ApoE4对线粒体功能的影响。评估Sirt3改变对ApoE3、ApoE4原代神经元线粒体功能、细胞代谢的影响。 方法： 1.使用出生后24小时内携带人ApoE3、ApoE4基因的转基因小鼠，体外剥去脑膜、血管，分离大脑皮层，胰酶消化后种于含neurobasalA、B27、L-谷氨酰胺、链霉素和青霉素的培养基中，置于含5%CO2的37℃培养箱中，进行细胞培养。 2.将外源小鼠Sirt3cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达Sirt3。构建靶向Sirt3764位点的19个核苷酸的短序列，将其克隆至OmicsLink小发夹RNA(shRNA)载体，以敲低Sirt3的表达，将shRNA载体、lenti-SIRT3载体和对照载体包装到慢病毒转染系统。细胞培养至7天时，慢病毒侵染ApoE3、ApoE4神经元，并应用嘌呤霉素进行筛选，成功转染的细胞表达绿色荧光。 3.Westernblot检测ApoE3、ApoE4神经元中Sirt3的表达水平。 4.MitoxpressXtra-氧消耗法和发光ATP检测试剂盒评估ApoE3、ApoE3+Sirt3shRNA、ApoE3+Sirt3cDNA、ApoE4、ApoE+Sirt3shRNA和ApoE4+Sirt3cDNA神经元耗氧量和ATP水平。 5.实验数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示，多组间比较用ANOVA检验，用GraphPadPrism统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时认为有统计学意义。 结果： 1.与ApoE3小鼠神经元相比，ApoE4小鼠神经元Sirt3表达水平下降。 2.氧消耗动力学显示ApoE4神经元氧耗率振幅降低、产生ATP明显低于ApoE3，ApoE4神经元氧耗率斜率升高。 3.与ApoE4神经元相比，ApoE4+Sirt3cDNA神经元氧耗率振幅升高、产生ATP增多，氧耗率斜率降低。ApoE4+Sirt3shRNA神经元氧耗率振幅降低、ATP产生减少，氧耗率斜率升高。与ApoE3神经元相比，ApoE3+Sirt3shRNA神经元氧耗率振幅降低、ATP产生减少，而氧耗率斜率没有明显变化。 结论： 1.ApoE4转基因神经元的Sirt3表达量下降，线粒体功能受损。 2.Sirt3介导了ApoE4神经元中线粒体功能的损伤。
NETL