摘要
克百威是氨基甲酸酯类广谱杀虫剂，可用于防治土壤内和地面上的300多种害虫和线虫。按照中国农药毒性分级标准，克百威属高毒农药，不能用在蔬菜和果树上，因此对其的监测十分必要。纳米抗体是骆驼科动物体内重链抗体的重链可变区，是目前最小的抗原结合片段(15 kDa)，论文基于纳米抗体的免疫分析方法具有灵敏度高、易表达、稳定性强、操作简单、检测效率高等优点，是近年来农药残留分析技术的热点。本研究以克百威为研究对象，通过免疫双峰驼，构建噬菌体展示纳米抗体文库，筛选获得特异性识别克百威的纳米抗体，并建立基于纳米抗体的免疫检测分析方法，用于实际样品的检测。主要结果如下： 1.抗克百威噬菌体展示纳米文库的构建、筛选及鉴定 以克百威类似物BFNB-KLH为免疫原，6轮免疫后采集双峰驼的外周血，提取RNA并扩增VHH基因，构建了一个库容为1.27×108cfu/mL的抗克百威纳米抗体文库，经辅助噬菌体M13K07救援后得到噬菌体展示纳米抗体库的滴度为1011pfu/mL。通过抗原-抗体固相吸附技术和药物竞争洗脱的方法进行了4轮淘筛，间接竞争ELISA方法鉴定选取阳性克隆。筛选得到9种不同序列的纳米抗体，其中，纳米抗体Nb316对克百威的抑制率最高，可达到95.3%，用于后续的研究。 2.抗克百威纳米抗体的制备及性能分析 将pComb3Xss-Nb316质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃，1mM的IPTG诱导条件下表达纯化获得纳米抗体Nb316，其表达量为2mg/L。热稳定性分析表明，纳米抗体Nb316在95℃下孵育1小时，与抗原的结合活性始终能保持在100%左右。有机溶剂耐受分析发现，甲醇浓度低于25%时，纳米抗体Nb316与包被原的结合活性可以保持在100%以上，甲醇浓度为50%时，结合活性仍有50%。乙腈浓度低于20%时，纳米抗体的结合活性不会降低，浓度为30%时纳米抗体仍具有50%的结合活性。ELISA法测定纳米抗体Nb316的亲和力，其亲和力常数为1.06×106L/mol。 3.基于纳米抗体的克百威IC-ELISA方法建立 建立了基于纳米抗体Nb316检测克百威的ic-ELISA方法，方法的IC50为7.27±0.88ng/mL，线性范围为1.44ng/mL-30.40ng/mL，最低检测限为0.65?0.24ng/mL。纳米抗体Nb316与丙硫克百威、仲丁威、丁硫克百威、3-羟基克百威和异丙威的交叉反应率分别为5.0%、3.5％、2.6％、2.0％和0.4％，与其余7种氨基甲酸酯类农药交叉率低于0.1%。蔬菜、水果的添加回收实验表明：大白菜的平均回收率在92.2％-104.0%之间，黄瓜的平均回收率在92.5%-102.3%之间，橙子的平均回收率在82.3%-87.5%之间，变异系数均在10%以内，回收率和稳定性均符合农药残留分析的要求。UPLC-MS/MS的检测结果与ic-ELISA方法相关系数达到0.9913，说明本论文建立的ic-ELISA方法精准度良好，可以用于克百威的实际样品检测。 4.铁蛋白展示纳米抗体的制备及性能分析 将Nb316基因通过重叠延伸替换Ferritin的?螺旋并构建到pET15b载体，转化至大肠杆菌transetta(DE3)中，表达并纯化得到铁蛋白展示的纳米抗体蛋白，表达纯化后的Ferritin-Nb316虽包含部分杂带，但相较Nb316表达量有所提升。ELISA法测定Ferritin-Nb316抗体的亲和力，亲和力常数为2.01×106L/mol，比纳米抗体Nb316亲和力提高了将近一倍。
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