摘要
2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种多因素的疾病，从上个世纪开始，其患病率就在逐年上升。这种疾病的发病过程十分复杂，最显著的发病特征为胰岛素信号通路受阻导致胰岛素抵抗，主要表现在胰岛素的靶器官对胰岛素信号敏感性降低。 白藜芦醇(Resveratrol，RSV)是在多种植物中发现的多酚类化合物，它是一种天然的植物抗毒素，自然界中主要以反式结构存在。1940年首先在白藜芦的根部分离出了白藜芦醇，之后在超过70种植物中被检测到，包括桉树、榕树等，其膳食来源主要包括红葡萄、桑椹、红酒等，在中药虎杖中的含量最高。大量的研究表明，白藜芦醇可以通过多种生物学作用来发挥改善胰岛素抵抗、治疗2型糖尿病及并发症的有益作用，主要包括抗炎、抗氧化应激、心血管和神经保护作用等。 长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)属于不编码蛋白的一类RNA，长度约200个核苷酸。lncRNA起初被认为是基因组转录的"噪音"，不具有生物学功能。然而，近年来有研究表明，lncRNA也参与了基因组印记以及染色质修饰等多种重要的调控过程，甚至在治疗T2DM中也起到了一定的作用。然而，目前为止，绝大部分lncRNA的功能和作用机制尚不清楚。本研究旨在通过建立体内(动物)和体外(细胞)胰岛素抵抗模型，探讨lncRNA在白藜芦醇改善胰岛素抵抗中的作用及其机制，为T2DM的治疗提供新思路和新靶点。 第一部分白藜芦醇对高脂喂养胰岛素抵抗小鼠肝脏脂质沉积的影响 目的：观察白藜芦醇对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠血糖、胰岛素、QUICKI、血脂以及肝脏脂质沉积的影响。 方法： C57BL/6J小鼠随机分为对照组(CON)12只和高脂组(HFD)24只。8周后行腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)，评估胰岛素抵抗模型是否建立，将HFD组小鼠随机抽取12只作为白藜芦醇干预组(HFD+RSV)，HFD+RSV组给予白藜芦醇100mg/kg/d每日一次灌胃，CON组和HFD组给予等体积含0.1%二甲基亚砜(DMSO)的0.9%氯化钠溶液灌胃。干预6周后，再次行IPGTT试验，检测0min、15min、30min、60min、120min血糖值并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。采集血清测空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，用酶联免疫吸附实验法(ELLSA)测空腹胰岛素水平并计算胰岛素敏感性指数(QUICKI)。留取肝脏组织标本进行H&E染色和油红O染色，观察肝脏组织病理形态变化及脂质含量。 结果： 1.高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗模型的建立 高脂饮食干预从第2周起，HFD组较CON组小鼠体重明显升高。8周末行IPGTT试验，HFD组较CON组小鼠在0min、30min、60min、120min血糖水平显著升高，与CON组相比，HFD组葡萄糖曲线下面积显著增加，证明胰岛素抵抗模型成功建立。 2.白藜芦醇干预6周各组小鼠体重及胰岛素抵抗参数的变化 HFD组小鼠体重较CON组显著增加，而白藜芦醇干预4周后，HFD+RSV组小鼠体重较HFD有明显变化。于6周末行IPGTT实验，HFD组较CON组小鼠在0min、15min、30min、60min、120min血糖水平明显升高，HFD+RSV组较HFD组相比小鼠在0min、30min、60min、120min血糖水平下降。与CON组相比，HFD组的AUC曲线下面积显著增加，与HFD组相比，HFD+RSV组的AUC曲线下面积显著下降。与CON组相比，HFD组的小鼠空腹血糖、胰岛素水平明显升高，而HFD+RSV组空腹血糖和胰岛素水平较HFD组明显降低。HFD组QUICKI值较CON组明显降低，白藜芦醇干预后，QUICKI值显著升高。 3.各组小鼠血脂水平比较 HFD组较CON组相比，TG、TC、LDL-C水平显著升高，HFD+RSV组较HFD组相比TG、LDL-C水平明显降低，HDL-C水平明显升高，TC水平未有明显变化。 4.各组小鼠肝脏组织形态学比较 H&E染色，CON组可见肝组织细胞结构清晰完整，胞浆均匀红染，脂滴空泡较少，未见明显脂肪变性；HFD组肝组织细胞结构紊乱模糊，胞浆内可见大小不等的脂滴空泡，脂滴将细胞核挤于细胞边缘，呈明显的脂肪变性；HFD+RSV组肝组织细胞脂肪变性明显减轻，脂滴空泡明显减少，形态变化介于CON组和HFD组之间。油红O染色，CON组可见蓝色的细胞核，橘红色脂滴数量较少；HFD组可见大量橘红色脂滴沉积；HFD+RSV组的脂滴明显减少，数量介于CON组和HFD组之间。 小结：高脂饮食可导致小鼠胰岛素抵抗及肝脏脂肪变性，白藜芦醇可明显改善高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性。 第二部分白藜芦醇干预高脂喂养小鼠肝脏lncRNA和mRNA的表达谱分析 目的：通过转录组测序分析，探讨白藜芦醇干预对高脂喂养小鼠肝脏lncRNA和mRNA表达谱的影响。 方法： 提取小鼠肝脏组织总RNA，构建测序文库，采用高通量测序技术进行转录组测序。使用Stringtie软件对每个基因区段内的fragment进行计数，并计算每个基因的FPKM(Fragments PerKilobase Million)值，根据FPKM值计算差异表达倍数foldchange，取其对数值log2(foldchange)用于筛选差异表达基因。然后通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)验证上述差异表达基因在各组肝脏组织中的相对表达水平。 结果： 1.小鼠肝脏lncRNA和mRNA的表达谱 转录组测序结果显示，小鼠肝脏组织中检测到总共51024个lncRNA和31055个mRNA，在HFD组与CON组相比有503个差异表达的lncRNA(344个上调和159个下调)和655个差异表达的mRNA(418个上调和237个下调)。与HFD组相比，HFD+RSV组有95个差异表达的lncRNA(46个上调和49个下调)和102个差异表达的mRNA(34个上调和68个下调)。火山图分析结果显示，HFD组与CON组之间以及HFD+RSV组与HFD组之间的lncRNA与mRNA表达差异显著。 2.小鼠肝脏中被白藜芦醇逆转的lncRNA和mRNA的表达谱 通过对CON组与HFD组以及HFD与HFD+RSV组差异表达基因取交集，发现与CON组相比，HFD组上调的lncRNA和mRNA中，有25个lncRNA和50个mRNA在HFD+RSV组被恢复下调。HFD组下调的lncRNA和mRNA中，有25个lncRNA和23个mRNA在HFD+RSV组被恢复上调。热图显示了CON组、HFD组和HFD+RSV组lncRNA和mRNA的表达值，并提示这三组间的表达模式间存在显著差异。 3.RT-qPCR验证7个lncRNA在三组中存在显著的表达差异。 对上述筛选结果进行定量RT-PCR检测，证实7个lncRNA在三组中存在显著的表达差异，其可能涉及白藜芦醇的作用机制。 小结：高脂饮食导致小鼠肝脏lncRNA和mRNA表达谱发生显著变化，而白藜芦醇干预可使部分lncRNA和mRNA表达水平逆转。提示lncRNA可能在白藜芦醇改善高脂诱导的小鼠胰岛素抵抗中发挥重要作用。 第三部分白藜芦醇干预高脂喂养小鼠肝脏mRNA表达差异的GO和KEGG分析及胰岛素信号通路相关mRNA表达验证 目的：通过GO和KEGG富集分析，找出在白藜芦醇改善胰岛素抵抗中差异表达的mRNA主要相关的生物学功能及信号转导通路，并探究与lncRNA之间的作用关系。 方法： 对每一个基因进行基于GeneOntology及KEGG数据库的注释。计算每个差异基因数目，筛选在差异基因中显著富集的GO和KEGG结果并找出与本研究相关的信号转导通路。通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测胰岛素信号通路相关分子SOCS3、Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1和G6PC表达水平。 结果： 1.白藜芦醇逆转的mRNA的GO及KEGG分析 差异表达mRNA的GO富集主要包括信号的负调节、分子功能负调节，酶联受体蛋白信号通路，酶抑制剂活性、内肽酶活性等。差异表达的mRNAsKEGGpathway分析主要包括代谢途径、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、胰岛素信号通路、细胞周期和脂肪细胞因子信号通路等。其中胰岛素信号通路与我们的研究相关，我们选择该通路并通过pathway分析预测出了关系密切的靶基因mRNASOCS3。 2.胰岛素信号通路相关基因mRNA水平比较 荧光定量RT-PCR检测结果显示，与CON组比较，HFD组小鼠肝脏FOXO1、SOCS3和G6PC的mRNA表达水平明显升高，而在HFD+RSV组上述mRNA水平得到明显回落。Akt的mRNA表达水平三组间无明显差异。 3.胰岛素信号通路相关蛋白表达的比较 Westernblot检测结果显示，与CON组相比，HFD组小鼠肝脏FOXO1、SOCS3和G6PC表达水平显著增加，而HFD+RSV组使其三种蛋白的表达水平有所回落。三组间总Akt蛋白水平无明显差异，但HFD组磷酸化Akt水平较CON组下调，而在HFD+RSV组得到了表达回升。同时与CON组相比，HFD组小鼠肝脏FOXO1的磷酸化水平下降，而在HFD+RSV组表达升高。 4.白藜芦醇对小鼠肝脏SOCS3免疫荧光结果的影响 免疫荧光染色结果显示，与CON组相比，HFD组小鼠肝脏SOCS3表达量明显增多，HFD+RSV组降低了HFD组SOCS3表达。此结果表明高脂饮食喂养的小鼠肝脏SOCS3表达水平增加，在白藜芦醇的干预下，SOCS3表达下降，即白藜芦醇在肝脏抑制了SOCS3的表达。 小结：白藜芦醇改变了高脂喂养的小鼠肝脏lncRNA和mRNA表达谱，GO和KEGG富集分析显示胰岛素信号通路具有显著关联，提示白藜芦醇可能影响胰岛素信号通路相关分子SOCS3、Akt、FOXO1、G6PC及相关lncRNA改善胰岛素抵抗。 第四部分NONMMUT008655.2在白藜芦醇影响胰岛素信号通路中的作用 目的：通过pathway分析选出与胰岛素信号通路相关的lncRNA，在细胞水平探讨筛选出的lncRNA在白藜芦醇改善肝脏胰岛素抵抗中的作用。 方法： 通过lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络和pathway分析预测，结合我们的测序结果，筛选出与胰岛素信号通路密切相关的lncRNANONMMUT008655.2。设计并合成其序列特异性siRNA，转染Hepa细胞，应用RT-PCR检测转染后NONMMUT008655.2的mRNA水平，评价转染效率。将Hepa细胞分为：对照组(CON)、PA干预组(PA)、PA+RSV30μM组(PA+RSV)、PA+RSV30μM+siRNA对照序列组(siRNA-NC)、PA+RSV30μM+NONMMUT008655.2-敲低组(siRNA-NONMMUT008655.2)。转染24h后，给予相应组PA和白藜芦醇，干预24h提取蛋白，westernblot检测目的基因表达。 结果： 1.NONMMUT008655.2lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络 在筛选出7个lncRNA中，NONMMUT008655.2的FPKM表达值最高且与靶基因mRNASOCS3关系密切，SOCS3的变化趋势与NONMMUT008655.2一致。 2.转染效率 与阴性对照组相比，siRNA转染组中NONMMUT008655.2的表达水平显著降低。 3.敲低NONMMUT008655.2后胰岛素信号通路相关指标的表达 与CON组相比，PA组FOXO1、G6PC、SOCS3表达明显升高，p-Akt、p-FOXO1表达明显下降。敲低NONMMUT008655.2后，与PA组相比，p-Akt、p-FOXO1表达明显上升，FOXO1、G6PC、SOCS3表达明显下降。白藜芦醇干预后，FOXO1、G6PC、SOCS3表达较PA组明显下降，p-Akt、p-FOXO1表达较PA组明显上升，差异均有统计学意义，与NONMMUT008655.2敲低组相比，p-Akt、p-FOXO1显著上升，FOXO1显著下降，而G6PC、SOCS3未有明显变化。 小结：白藜芦醇减轻了PA诱导的HEPA细胞胰岛素抵抗，影响了胰岛素信号通路分子的表达；而敲低lncRNANONMMUT008655.2可部分呈现白藜芦醇的作用效果。提示，白藜芦醇可能通过下调NONMMUT008655.2来发挥其改善胰岛素抵抗的作用。 结论： 1.高脂饮食可导致小鼠胰岛素抵抗，白藜芦醇干预能够影响肝脏胰岛素信号通路，改善高脂诱导的小鼠胰岛素抵抗。 2.白藜芦醇干预高脂饮食小鼠的肝脏lncRNA和mRNA表达谱均发生了显著变化，且与胰岛素信号通路具有显著关联。 3.白藜芦醇可以下调肝脏lncRNANONMMUT008655.2水平，其可能在白藜芦醇改善高脂诱导的小鼠胰岛素抵抗中发挥重要作用。
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