摘要
背景：阿尔茨海默氏症是一类神经系统退行性疾病，其主要的病理学表现之一是神经细胞外存在大量由淀粉样蛋白聚集而成的老年斑。β-淀粉样蛋白(Aβ)是老年斑的重要组成成分。β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的转运机制是AD病理研究的重要内容，其在胞内存在多种分选转运途径，而且APP的转运及剪切异常会导致Aβ过多释放和积累，造成突触障碍、老年斑沉积和神经元死亡。以往关于APP转运机制的研究主要集中在非神经元细胞中，而在神经元中的分选转运途径尚不清晰，特别是APP从反面高尔基体到内涵体的囊泡运输。AP-1复合体是一类能特异性识别分选信号并介导细胞内某些特定蛋白在反面高尔基体网状结构(TGN)和内涵体(endosome)之间运输的网格蛋白适配蛋白。本项目前期通过同位素标记差异蛋白分析技术iTRAQ筛选了一批早期阿尔茨海默氏症病变中存在改变的转运相关蛋白，发现AP-1复合体的衔接蛋白σ1A亚基(σ1Aadaptin，又称为AP19)在早期AD模型小鼠海马区表达增高，且影响APP膜表达及剪切，我们推测AP19蛋白参与APP在高尔基体及内涵体之间的分选转运过程。 目的：(1)研究AP19蛋白对APP分选、转运及剪切的调控机制；(2)检验AP19蛋白功能失调是否参与阿尔茨海默氏症发病机制。 方法：利用His标签蛋白琼脂糖纯化树脂纯化His-AP19融合蛋白(以包涵体的形式存在)，再用提纯得到的AP19蛋白对免疫血清进行纯化分离；在HEK293T细胞内或原代培养神经元中共表达野生型APP和AP19蛋白以及突变型APPswe和AP19蛋白，利用免疫印迹法检验APP剪切状态，酶联免疫吸附测定(ELISA)检验细胞外Aβ42释放及聚集状态，同时利用免疫荧光手段对APP和各类囊泡标记物进行共定位分析，观察APP在细胞内的分布改变。另外，我们还构建了针对AP19基因的shRNA质粒用于敲减AP19。 结果：在与AP19共表达后，APPwt、APPswe的总体表达量均有明显的下调。利用qRT-PCR检测APP的mRNA表达水平，结果显示，与AP19共表达会影响APPwt及APPswe的mRNA表达。另外，APPswe实验组的C端水解产物总CTF产量也有增加，Aβ42产生量也有明显的增加。在神经元胞体内的共定位实验中，我们发现AP19会促进APPswe与AP-1复合体大亚基adaptinγ、早胞内体共定位。因此，AP19质粒过表达一方面可能非特异性影响APP的基因转录，另一方面AP19也会参与APPswe蛋白的转运途径。 结论：AP19介导APP在高尔基体及内涵体之间的分选转运过程，并且对APPwt及APPswe存在差异性的转运调节作用。
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