摘要
第一部分结直肠癌中BRAFV600E基因突变与肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞的关系 目的：探讨结直肠癌中肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞与BRAFV600E基因突变之间的关系。 方法： 1.收集河北医科大学第四医院2014年8月至2019年3月的结直肠癌患者的临床资料及术后肿瘤组织标本。其中BRAFV600E突变型结直肠癌患者10例，另外将20例BRAF野生型结直肠癌患者作为对照，评估BRAFV600E突变与临床病理参数之间的关系。 2.使用免疫组化法对30例结直肠癌患者的术后组织标本染色，计数肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞，分析肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤相关成纤维细胞与BRAFV600E突变的关系。 结果： 1.在结直肠癌中，BRAFV600E突变与CA19-9水平和肿瘤分化程度密切相关(P＜0.05)，与年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、淋巴结转移、脉管癌栓、神经侵犯、PLT计数、CEA水平均无显著性差异(P＞0.05)； 2.BRAFV600E突变型结直肠癌组织中M2型巨噬细胞含量高于BRAF野生型(P＜0.05)； 3.BRAFV600E突变型结直肠癌组织中CAFs的表达与BRAF野生型结直肠癌组织相比无显著性差异(P＞0.05)。 结论： BRAFV600E突变型CRC患者术前CA19-9水平较高，肿瘤组织多为低分化，且肿瘤组织中M2型巨噬细胞含量高于BRAF野生型，抑制M2型巨噬细胞向肿瘤微环境中的浸润，有可能是治疗BRAFV600E突变CRC的一种策略。 第二部分沉默BRAF基因的BRAFV600E突变型结肠癌细胞株外泌体对巨噬细胞及成纤维细胞的影响 目的：探讨沉默BRAF基因的BRAFV600E突变型结肠癌细胞株外泌体对巨噬细胞及成纤维细胞表型和分泌功能的影响。 方法： 1.使用超速离心法提取HT29细胞和1627细胞上清液中的外泌体；使用透射电子显微镜观察外泌体的形态及大小；使用Westernblot法检测外泌体特异标记物CD9、CD63的表达。 2.分别将HT29细胞来源的外泌体(HT29exo组)和1627细胞来源的外泌体(1627exo组)与THP-1巨噬细胞(100ng/mLPMA诱导48h所得)共培养48h，收集细胞和上清液。使用流式细胞学检测共培养后巨噬细胞CD163的表达，使用ELISA法检测巨噬细胞上清液中细胞因子IL-6、TGF-β1的表达水平。 3.分别将HT29细胞来源的外泌体和1627细胞来源的外泌体与MRC-5成纤维细胞共培养48h，收集细胞和上清液。采用Westernblot法检测共培养后成纤维细胞α-SMA、FAP的表达，采用ELISA法检测成纤维细胞上清液中细胞因子IL-6、TGF-β1、VEGF的表达水平。 结果： 1.透射电子显微镜可见收集到的外泌体具有典型脂质双层膜结构，直径为30-150nm，符合外泌体的形态特征，且均表达外泌体特异标记物CD9、CD63； 2.沉默BRAF基因后，BRAFV600E突变型结肠癌细胞来源的外泌体对巨噬细胞的影响(1)相较HT29exo组，1627exo组巨噬细胞CD163表达下降(P＜0.05)；(2)相较HT29exo组，1627exo组巨噬细胞分泌的IL-6水平下降，TGF-β1水平升高(P＜0.05)； 3.沉默BRAF基因后，BRAFV600E突变型结肠癌细胞来源的外泌体对成纤维细胞的影响(1)相较HT29exo组，1627exo组成纤维细胞中α-SMA、FAP的表达水平无明显变化(P＞0.05)；(2)相较HT29exo组，1627exo组成纤维细胞分泌IL-6、TGF-β1、VEGF的水平明显下降(P＜0.05)。 结论： 沉默BRAF基因的BRAFV600E突变型结肠癌细胞来源的外泌体能够抑制巨噬细胞向M2型分化，还能抑制成纤维细胞分泌IL-6、TGF-β1、VEGF，以BRAF为靶点的基因治疗可能是未来结直肠癌治疗的方向。
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