摘要
外来动物疫病的传播往往会造成严重的经济损失，从而直接威胁到国家的经济发展以及社会的和谐稳定。近年来，随着我国进出口贸易日益频繁，外来动物疫病传入我国的风险也与日俱增，因此，对外来病原的检疫越来越被重视。非洲猪瘟(ASF)、小反刍兽疫(PPR)、西尼罗热(WNF)、裂谷热(RVF)、南非型口蹄疫(SAT FMD)是我国明确指出要重点防范的外来动物疫病，因此针对这五种病原建立一种既快速又准确的检测方法用于这些疫病的检疫工作，具有重要的意义。液相芯片是近几年发展的一种新型的高通量检测技术，该方法具有操作简便、耗时短、高通量以及准确性高的优点，适合大量样品的高通量快速检测。本研究旨在通过单重液相芯片和多重液相芯片两方面的研究建立可同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、西尼罗病毒(WNFV)、裂谷热病毒(RVFV)和南非型口蹄疫病毒(SAT FMDV)5种病毒的核酸液相芯片检测方法，为外来疫病的快速准确检测提供一种新的检测方法。 根据GenBank上公布的ASFV的p72基因序列、PPRV的N蛋白基因序列、WNV的E蛋白基因序列、RVFV的S片段基因序列和FMDV南非型(SAT1、SAT2、SAT3)5'UTR区基因序列进行比对分析，针对各病毒的高度保守区设计引物与探针。对探针进行C12臂修饰后与荧光编码微球偶联，并通过生物素标记的验证探针对各微球偶联效率进行验证。之后对目的片段进行不对称PCR扩增，将扩增后的PCR产物与偶联微球的探针进行杂交，在Bio-Plex系统上读取中住荧光值(MFI)，根据判定标准分析结果。 通过对不对称PCR上、下游引物比例、杂交温度和时间等反应条件的优化，成功建立了ASFV、PPRV、WNV、RVFV以及SAT FMDV5种病毒的单重液相芯片检测方法，该方法各病毒之间不发生交叉反应，具有良好的敏感性与特异性。在此基础上，通过多重病毒的特异性、敏感性和稳定性试验建立了可同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和SAT FMDV5种病毒的多重液相芯片检测方法。应用该多重液相芯片检测方法对106份野生动物及家畜样品进行了检测，其中检出PPRV阳性样品15份，其余病毒检测结果均呈阴性。通过与常规PCR检测结果比对，符合率为100％。 本实验成功建立了非洲猪瘟(ASF)、小反刍兽疫(PPR)、西尼罗热(WNF)、裂谷热(RVF)、南非型口蹄疫(SAT FMD)5种病毒核酸的单重及多重液相芯片检测方法，为重大外来疫病的检测提供了新的方法，同时也为其他病原的检测提供了新的思路。
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