摘要
生殖细胞是高等生物中唯一能够将遗传信息传递给下一代的一类细胞，正确的生殖细胞发生与生殖谱系的发育，对于物种的延续至关重要。生殖细胞发育包括原始生殖细胞发生、迁移、性腺形成、生殖细胞增殖和减数分裂、配子成熟等一系列步骤。这些发育环节的失调都可能导致生殖细胞发育异常，进而不仅造成个体不育和出生缺陷、而且也可能导致肿瘤的发生。在生殖细胞分裂过程中RNA结合蛋白扮演者重要的角色，但是已知的参与调控生殖细胞的RNA结合蛋白并不多，RNA结合蛋白在原始生殖细胞发生和维持中作用机制也不清楚。 环状RNA作为一类新型的闭合共价结构的RNA分子，在癌症样本中表达量显著下降，可以作为癌症和疾病的生物标记物。对于其产生机制，大多数的报道认为在Pre-RNA剪接过程中，由RNA结合蛋白参与。近年来，研究表明动物表达大量单链RNA分子，它们在5'和3'端(circRNA)共价封闭，所有迄今为止研究的哺乳动物circRNA都是反向剪接的结果，其中剪接体将外显子的3'末端与同一转录本的相同或不同外显子的上游5'末端连接在一起。反向剪接取决于背景，circRNA通常在组织和发育阶段特异性表达，但是目前其生物学功能并不清楚。Qkia是一个RNA结合蛋白，文章报道其可以参与RNA的剪接过程，并且能够结合在内含子中，影响环状RNA的生成，但是对其具体的生物学过程却知之甚少。 为了探索RNA结合蛋白Qkia在斑马鱼早期胚胎PGC发育中的功能，以及对环状RNA的影响。本研究以斑马鱼为模式动物，利用基因敲除CRISRP-Cas9技术，构建了Qkia敲除的斑马鱼，最后得到了两个突变系的斑马鱼，通过对表型观察发现，Qkia缺失以后，斑马鱼在发育到3天以后表现为体节弯曲，身体规律性的出现颤抖现象，并且在发育到10天左右死亡。进一步对早期胚胎PGC进行原位杂交实验，发现Qkia敲除以后，早期胚胎在发育到12hpf和24hpf时期PGC的迁移出现异常，提示Qkia对维持生殖细胞的正常迁移是必须的。为了研究Qkia敲除以后，环状RNA的表达谱的变化情况，对敲除Qkia的胚胎中的环状RNA的表达进行了深度测序，利用环状RNA的分析方法发现，敲除Qkia后，有396个显著下调和90个显著上调的环状RNA。由于环状RNA通常作为microRNAs的诱饵或者海绵结构，能够和microRNAs结合，从而抑制其生物学功能。进一步对差异性表达的环状RNA序列中含有的microRNAs的结合位点进行分析，结果发现，这些环状RNAs对miR-182的结合指数最高。通过在斑马鱼中敲低和过表达miR-182，结果都表明，miR-182能够与其靶基因Sdf1a的3'-UTR区域结合，调控其表达，从而影响PGC的迁移。通过对Qkia蛋白的亚细胞定位研究发现其主要定位于细胞核，并且在细胞核内形成granules，这表明其可能在细胞核中结合pre-RNA发挥剪切功能。生信分析发现，Qkia结合的motif序列为AUAACU，EMSA实验也验证了Qkia蛋白可以和其motif结合，参与环状RNA的生物学发生过程。体外原核纯化的Qkia全长蛋白，能够发生典型的相变现象，但是其低复杂度结构域对其相变的影响不明显，去除低复杂度结构域以后，仍然能够发生相变现象。 综上所述，发现了Qkia和环状RNA的新的生物学功能，证明Qkia对斑马鱼的存活及早期PGC的正常迁移是必须的，其主要机制是通过调控环状RNA的生成，其作为miR-182的海绵结构，抑制其生物学功能，从而对其靶基因Sdf1a进行调控，并最终影响原始生殖细胞的正常归巢。本研究加深了对RNA结合蛋白在胚胎发育过程中调控的认识，对研究原始生殖细胞迁移具有重要的意义。
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