摘要
组蛋白分子伴侣以不依赖ATP的方式介导组蛋白与DNA相互作用，并在反应结束后不残留在反应产物核小体中。HIR复合体是进化高度保守的组蛋白H3/H4的分子伴侣，广泛存在于酵母、果蝇、植物和人源细胞中。HIR负责组蛋白基因转录的调控，介导不依赖复制的H3/H4堆积，沉默组蛋白基因表达和转录沉默异染色质。HIR参与核小体组装，对维持基因组完整性和通过核小体组装来调整染色质结构进而维持细胞动态平衡有直接作用。与酿酒酵母HIR复合体同源的人源HIRA复合体参与胚胎发育、血管生成、细胞衰老和老化等生命进程。人源HIRA复合体的缺失，会导致DiGeorge综合征，不能维持HIV潜伏期，还会引起血管再生缺陷。酿酒酵母HIR复合体包括4个亚基，分别为Hir1、Hir2、Hir3及Hpc2，其中最大亚基Hir3的分子量达到191kDa。由于HIR复合体天然含量极低、表达困难，至今尚无完整HIR或HIRA复合体的完整结构，其亚基排布和作用网络未知，因此其执行组蛋白分子伴侣活性的机制尚不清楚。 为了获取足量的酵母HIR复合体进行冷冻电镜（cryoelectron microscopy,cryo-EM）结构研究，利用双向启动子GAL1-10构建了完整HIR复合体的酵母超表达体系。通过优化不同亲和纯化标签及其组合，并结合BS3交联以及甘油密度梯度离心，纯化获得了纯度较高的完整酵母HIR复合体，并进行了生化和质谱鉴定。针对HIR复合体冷冻制样过程中的易碎且分布不均的问题，优化了冷冻制样条件、载网及承载膜，获得了分布均匀适于收取冷冻电镜数据的样品。经过负染及冷冻电镜数据收集和初步三维重构，已构建了HIR复合体的三维结构初始模型。上述研究为HIR复合体的高分辨率冷冻电镜三维结构研究、亚基定位奠定了基础，有助于进一步探究组蛋白分子伴侣与相应组蛋白相互作用的结构机制和动态过程，为阐明HIR复合体执行其组蛋白分子伴侣活性的机制奠定基础。 为了进一步简化HIR等天然含量较低且易碎的超大分子复合体的纯化步骤并加速冷冻制样过程，还探索发展亲和载网方法，以期实现在细胞裂解液中直接亲和纯化插入PA标签的目的蛋白至亲和载网并直接冷冻制样的最终目标。已实现应用Pyr-NHS（1-Pyrenebutyric acid N-hydroxysuccinimide ester）将与PA标签紧密结合的NZ-1Fab(NZ-1抗体的Fab)化学固定在载网的碳膜上，并在测试蛋白apoferritin的N端（暴露在复合体外表面）插入了PA标签。我们的实验表明带有PA标签的apoferritin能够在结合了在覆盖了NZ-1Fab的载网上富集，但无法在没有NZ-1Fab的对照组载网上富集，证明了该亲和载网方法的初步成功。后续将进一步解析应用该方法直接纯化并冷冻制样的apoferritin能达到的三维重构的分辨率，并进一步推广到HIR及低丰度或易碎的大分子复合体的直接纯化和冷冻电镜结构解析中。
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