摘要
NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是苹果酸代谢通路中的关键酶，它不仅参与植物的光合作用，还参与植物的环境逆境防御及相关代谢活动。课题组前期的研究表明，C3-C4中间型植物松叶猪毛菜通过增强C4途径来抵御干旱胁迫，并且在所研究的光合酶中，仅有NADP-ME活性在不同程度的干旱胁迫下都显著升高，暗示该基因在松叶猪毛菜响应逆境胁迫中具有重要作用。并且，植物光合基因NADP-ME进化关系复杂，为我们认识C4光合基因的进化提供了很好的素材。 本研究拟克隆松叶猪毛菜NADP-ME家族基因，分析NADP-ME组织表达特性及响应逆境胁迫的模式，并验证松叶猪毛菜叶绿体型NADP-ME在非生物胁迫下（光照、干旱和盐）的功能;同时探究NADP-ME家族基因在被子植物中的动态演化规律。主要结果如下: 1.基于松叶猪毛菜的根、茎和叶混库建立的转录组数据，本文克隆获得了3条NADP-MEs，命名为Salchl，Salcyt1和Salcyt2。①它们的CDS（编码氨基酸的序列）长度分别为1941bp，1755bp，1758bp，编码646，584，585个氨基酸，这3个基因均含有NADP-ME的5个保守结构域。②通过亚细胞定位研究表明，Salchl编码的蛋白定位于叶绿体，Salcyt1和Salcyt2编码的蛋白均定位于细胞质。③在转录水平上，这3个基因在松叶猪毛菜根、茎和叶中都有表达，但没有明显的组织特异性表达模式;在强光、干旱和盐胁迫下松叶猪毛菜幼苗根和叶中这3个NADP-ME具有不同基因转录表达方式，其中Salchl的转录表达被这3种处理显著诱导，且在根和叶中有一致性。 2.将Salchl稳定转化至拟南芥中进行功能验证。结果表明:①正常条件下，过表达Salchl能提高转基因拟南芥植株的光合能力。与WT相比，转基因植株的光系统相关基因(Psb D、Psb Q、Psa F、Psa H)和捕光色素相关基因（CHL M、Por B、LHC A2、LHC H4、LHC B3）的表达量、ETR（光合电子传递速率）、Y(Ⅱ)（实际光能转化效率）以及叶绿素含量都有明显的增加;②对WT和过表达Salchl转拟南芥植株进行强光、干旱和盐胁迫下的对比研究，与WT相比，种子萌发阶段，过表达Salchl不能提高植株抗盐、强光和干旱能力;幼苗阶段过表达Salchl能不同程度的提高拟南芥植株的根长，鲜重和侧根数目;在成苗阶段，盐，干旱和强光胁迫下，过表达Salchl拟南芥的H2O2含量减少，脯氨酸含量增加，表明过表达Salchl能提高植株抗逆能力。盐和强光胁迫下，转基因植株ROS酶促系统的SOD，POD和CAT含量增加;干旱胁迫下，转基因植物ROS非酶促系统的ASA/DHA，GSH/GSSG比值增加。并且，在3种非生物胁迫下，转基因植株的光能转化速率及电子传递能力都增加 3.基于涵盖被子植物关键节点的64个物种的282条NADP-ME序列，并以藻类、苔藓、蕨类和裸子植物的10个物种的28条NADP-ME序列为外类群，从系统发育和序列特征入手，利用生物信息学手段探究NADP-ME家族在被子植物中的演化历史。结果表明:①单/双子叶植物的NADP-MEs在基因复制/丢失事件、基序组成和分布上均存在差异。②与NADP-ME的5个保守域相比，胞质型NADP-ME序列在每个保守区域都发生许多变化。但质体型NADP-ME只在保守区Ⅱ的保守序列中存在较多的变化。③4条藻类植物序列位于外类群基部且与其他外类群序列区分开来。将这些被子植物的NADP分为5个类型，包括2个双子叶胞质型（Ⅰ和Ⅲ），其中双子叶胞质型首先分化出来;双子叶质体型(Ⅱ)，嵌套在双子叶胞质型中;1个单子叶胞质型(Ⅳ)和1个单子叶质体型(Ⅴ)。④根据系统发育树、蛋白质长度和内含子数目的不同，将Ⅴ组分为两个支持良好的亚组(V-1和V-2)。⑤在V-1中，光合型NADP-ME嵌套在质体型非光合型NADP-ME中，两者在内含子数目和蛋白质长度上有相似性。 以上研究结果阐明了松叶猪毛菜NADP-ME家族基因的特性，并确定了非生物胁迫下（强光、干旱和盐）Salchl的抗逆功能，同时，理清了NADP-ME家族（特别是对于质体亚型）在被子植物中的系统发育关系。
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