摘要
Nanog是维持细胞全能性和自我更新能力的一个中心分子。已有研究表明在斑马鱼中，Nanog参与调控母源合子转换、中内胚层的诱导等重要的发育过程，同时有研究者认为Nanog主要通过调控胞外组织的形成而参与早期胚胎发育。然而，作为一个在成熟卵子中高量表达的基因，Nanog在斑马鱼卵子成熟及卵子质量控制过程中具体扮演何种角色，以及调控不同的生物学事件是否可以利用一个统一的理论加以解释，这都是悬而未决的重要问题。 本论文通过实验室前期构建的斑马鱼nanog突变品系深入揭示了一个存在于卵子成熟和早期胚胎发育过程中的Nanog-Cyp11a1-Pregnenolone轴:Nanog作为转录激活子，在卵子成熟过程中激活母源基因cyp11a1的转录，促进微管稳定因子孕烯醇酮(pregnenolone，P5)的产生，使得P5在卵母细胞中累积;在卵子授精后，合子基因激活之前，在卵子中积累的P5通过调控早期胚胎中微管的组装，促进卵子激活以及母源物质的运输;在合子基因激活之后，Nanog持续激活cyp11a1，促进P5合成，进一步促进胚胎外组织中微管的组装，促进卵黄合胞体层(yolk syncytical layer，YSL)形成以及原肠运动等等一系列胚前和胚后发育过程。具体发现如下: 1)发现斑马鱼nanog的母源合子突变胚胎（MZnanog）表现出严重的细胞骨架组装、卵黄合胞体层形成以及原肠运动等缺陷，且这些缺陷是由于cyp11a1基因在突变体中表达缺失所导致。在MZnanog胚胎中，位于卵黄合胞体层(yolk syncytial layer，YSL)和卵黄胞质层(yolk cytoplasmic layer，YCL)中的微管聚合显著减少;卵子激活阶段依赖于微管进行运输的母源物质无法正确由植物极转运至动物极;依赖于细胞骨架提供动力的外包运动无法完成等。转录组测序显示合成孕烯醇酮的关键酶——胆固醇侧链裂合酶的编码基因cyp11a1的转录水平在MZnanog突变体中剧烈下调，并且通过过表达cyp11a1可以显著拯救MZnanog突变体的微管组装、母源物质运输和原肠运动缺陷。 2)揭示cyp11a1是Nanog在转录水平直接的靶基因，且突变体中cyp11a1表达丧失所导致的P5水平降低是其微管组装缺陷的直接原因。MZnanog突变体中，Cyp11a1的酶促底物胆固醇大量累积并分布异常;同时Cyp11a1的酶促产物，促进微管组装的孕烯醇酮水平显著下降。类似于cyp11a1过表达，通过P5浸泡，也可以拯救MZnanog中的微管组装、母源物质运输和原肠运动缺陷。进一步，利用染色质免疫共沉淀、点突变和荧光素酶法检测启动子活性等实验手段，揭示Nanog作为转录因子直接结合在cyp11a1的启动子区域，激活其转录。 3)从微管组装和物质运输的层面，揭示了Nanog在调控胚胎内细胞命运决定和胚胎外组织YSL及YCL结构与功能的协调统一性。YSL特异性敲降nanog或cyp11a1导致胚胎外组织中微管的组装缺陷、YSL以及中内胚层的缺失;在MZnanog中，YSL特异性过表达nanog或cyp11a1又可以拯救其微管组装缺陷和YSL和中内胚层缺失的表型。但YSL特异性过表达nanog的同时敲降cyp11a1将不能拯救MZnanog。说明Nanog对YSL和中内胚层分化的调控依赖于其cyp11a1的激活和细胞外组织中微管的组装。 4)构建了cyp11a1的母源合子突变体（MZcyp11a1），揭示MZcyp11a1突变体中cyp11a2基因的遗传补偿是掩盖突变体表型的直接原因。利用CRISPR/Cas9技术构建了cyp11a1斑马鱼突变品系，然而MZcyp11a1没有表现出与cyp11a1敲降或MZnanog突变胚胎一致的细胞骨架和原肠运动缺陷。通过遗传互作、cyp11a1，cyp11a2双突变体构建等一系列实验，揭示了MZcyp11a1中发生的遗传补偿效应，即cyp11a1的旁系同源基因cyp11a2在突变体中出现了补偿性的高量表达，由一个严格的合子基因转变为具有母源表达，且与cyp11a1时空表达相似的母源合子基因。利用MZcyp11a1这一遗传补偿模型，揭示斑马鱼upf3a在介导无义RNA降解和遗传补偿发生中占据重要地位。 5)系统分析了母源β-catenin信号核内组分在发育早期的表达谱式和Tle家族基因缺陷的表型。发现wnt配体及β-catenin在卵母细胞及成熟卵子中广泛表达，同时母源β-catenin蛋白不仅仅在囊胚期胚胎背侧入核，而是整个囊胚细胞中均有入核，但在背侧较多，腹侧较少;尽管MZnanog中母源β-catenin的靶基因显著上调，然而在MZnanog中不论是Wnt配体，β-catenin的转录水平以及β-catenin的入核水平均没有增加，表明Nanog并不是通过增加β-catenin的入核来促进母源β-catenin信号活性;发现斑马鱼中，经典的Wnt/β-catenin的拮抗因子Tle家族基因也具有母源表达，但敲降Tle基因不会导致母源β-catenin信号通路的激活。进一步构建Tle家族成员的敲除突变体，证明母源表达的Tle家族成员并不参与在核内抑制母源β-catenin活性。以上实验更加深刻地表明Nanog是斑马鱼中抑制腹侧β-catenin异位激活以及背侧β-catenin适度激活的关键因子。
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