摘要
甘青青兰（Dracocephalum tanguticum Maxim），是藏药常用药材之一。本研究建立了基于高速逆流色谱技术(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)的甘青青兰化学成分的高效分离方法，应用HSCCC梯度流速洗脱、循环洗脱和中心切割模式的分离技术，主要取得以下结果: 1.采用大孔树脂柱层析结合中压制备色谱(Medium Pressure Liquid Chromatography，MPLC)，建立了甘青青兰中绿原酸的绿色高效的大规模制备工艺。应用响应面法对甘青青兰中绿原酸的提取工艺进行优化。优化工艺为:提取温度70℃，提取时间3h，液料比15∶1，乙醇浓度75％。在优化工艺条件下，提取物中绿原酸的含量高达6.68％;通过对六种不同性能的大孔树脂的筛选，采用AB-8树脂在25℃条件下，用水洗脱2BV以除去杂质，再收集第3-5BV洗脱组分富集绿原酸，含量达到74.94％，回收率为82.82％;采用MPLC，以10％乙醇为流动相进行洗脱，进一步纯化绿原酸，含量达到98％，回收率为89.27％。采用此工艺，绿原酸含量由提取物中的6.68％提高到98.00％，回收率为72.65％。 2.建立了基于HSCCC的梯度流速洗脱模式、循环洗脱模式和中心切模式相结合的新策略来分离甘青青兰中极性相近化合物。首先，采用梯度流速模式:1.5mL/min,0-160min;1.8mL/min,160-200min;2.0mL/min,200-400min。使极性相近化合物3和4成功分离，同时分离得到化合物5。对于未分离的极性相近的化合物1和2，应用循环洗脱结合中心切割的模式，分离得到化合物1和2。经鉴定，五种化合物为:波斯菊苷(1)，胡麻苷(2)，芦丁(3)，胡麻苷-6"-乙酸酯(4)，sorbifolin-6-O-β-glucopyranoside(5)。 3.建立了基于MPLC和HSCCC相结合甘青青兰中三种微量成分高效富集和分离制备工艺。首先，应用MPLC富集到三种微量成分，峰面积比例由粗提物中的0.08％提高到85.30％;然后，采用HSCCC，以正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1.18∶8.82∶1.18∶8.82，v/v)溶剂系统，建立了循环洗脱结合中心切割的洗脱模式，分离得到三种微量成分，分别为3-phenylethyl-β-D-Glucopyranoside(6)，tazettosideE(7)，cirsiliol-4'-glueoside(8)，其中化合物(6)和(7)为甘青青兰中首次分离得到。 4.建立了基于HSCCC从甘青青兰粗提物中直接分离三种主成分的高效分离制备工艺。以用乙酸乙酯/正丁醇/0.3％冰醋酸(4∶1∶5，v/v)溶剂系统，以DMSO为助溶剂以增大样品溶解度并提高进样量，经HSCCC一步分离得到3个目标化合物组分;经制备高效液相色谱(prep-HPLC)进一步纯化，得到纯度98％以上的3个目标化合物，分别为绿原酸(9)、胡麻苷(2)和胡麻苷-6"-乙酯(4)。 本研究应用HSCCC传统洗脱模式、循环洗脱模式、中心切割洗脱模式，分离甘青青兰中的主成分、微量成分及极性相似化合物。进一步完善了甘青青兰的物质基础研究，同时为HSCCC在天然产物化合物分离中的应用提供了参考。
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