摘要
土传病害的绿色防控是当前农业、生态和环境领域的研究热点。从揭示功能物质的作用机制入手，研究开发高效土壤改良剂，可能是有效防控土传病害、解决连作障碍导致的土壤退化问题、实现农业可持续发展的重要途径。腐殖酸对土传病原真菌存在抑制作用，但是其构效关系及形成机制仍不清楚。本文采用不同原料来源的腐殖酸，通过测定腐殖酸的元素含量及其碳组成、腐殖酸对不同土传病原真菌的抑制率、腐殖酸添加至连作土壤后真菌群落变化、腐殖酸添加至病原菌Rhizoctonia solani的培养体系中其转录组变化、以及腐殖酸与农药百菌清配用对Fusarium oxysporum生长代谢的影响，研究腐殖酸化学结构中具有真菌活性抑制作用的相关组分，解析构效关系，阐释腐殖酸对土壤真菌群落的影响，明确腐殖酸对生物农药的增效作用，揭示腐殖酸的抑菌机制。以期从化学和分子生物学角度为开发腐殖酸用于土传真菌病害的绿色防控提供科学依据。研究取得如下主要进展: 1)从14种不同的原料中提取出腐殖酸，分析其元素含量[碳(C，carbon)，氮(N，nitrogen)，硫(S，sulfur)，氧(O，oxygen)]和有机碳组分的相对丰度，测定其对10种土传病原真菌的抑制作用。结果表明:木本泥炭腐殖酸的C含量最高，N和S含量最低;太湖底泥腐殖酸的S含量最高，O含量最低;泥炭和煤腐殖酸中的N含量明显低于堆肥和土壤腐殖酸中的N含量;太湖底泥腐殖酸、畜禽粪便堆肥腐殖酸和花生秸秆堆肥腐殖酸的S含量均大于1％。羰基C、芳香C-O、芳香C、异头C、烷氧C、O-CH3/NCH和烷基C含量的变化范围分别为9.7％～16.9％、6.3％～12.8％、13.6％～64.8％、3.2％～8.5％、0.7％～16.2％、0.6％～16.0％、11.6％～35.8％。水稻土、太湖底泥和堆肥腐殖酸的芳香度(ARO，aromaticity)均小于50％，而黑土和所有煤类腐殖酸的ARO均大于60％。草本泥炭和藓类泥炭腐殖酸的ARO＜50％，木本泥炭腐殖酸的ARO为50.61％。所有腐殖酸对供试的10种土传病原真菌均存在抑制作用，且云南褐煤对Physalospora piricola的抑制率（IR，inhibition rate）最高，达到85.3％。Mantel检验和冗余分析（RDA，redundancy analysis）被用于评估结构-活性之间的构效关系。Mantel检验表明，N、S、O、N/O、羰基C、芳香C-O和异头C含量与抑制率显著相关。RDA分析表明，S含量与抑制率呈正相关，而O含量与抑制率呈负相关;羰基C含量与抑制率呈正相关，而异头C和芳香族C-O含量与抑制率呈负相关。另外，植物毒性试验结果得到所有腐殖酸的发芽指数（GI，germination index）均大于70％，表明所有的腐殖酸均有利于植物生长。 2)选用三种溶剂(NaOH-Na4P2O7，KOH，KOH-CH3CH2OH)从风化煤中提取腐殖酸，对提取出的腐殖酸同样进行元素含量、碳组分、真菌活性抑制率的测定。结果表明:与NaOH-Na4P2O7和KOH提取的腐殖酸相比，KOH-CH3CH2OH提取的腐殖酸C含量最高（分别为73.58％和71.32％），N、O含量最低（N分别为0.61％和0.71％;O分别为19.11％和20.47％）;烷基C含量增加(含量范围从12.39％～18.74％增加到29.24％～30.03％);异头C含量降低（含量范围从7.04％～10.95％降低到4.09％～4.20％）。同时得到KOH-CH3CH2OH提取的腐殖酸的ARO最小，而真菌活性抑制率最高(71.86％);即不同溶剂提取出的腐殖酸化学结构和真菌活性抑制率均存在显著差异。RDA和偏最小二乘回归(PLSR，partial least squares regression)分析得到:元素C和S对真菌活性抑制率呈正效应，N和O则呈负效应;同时腐殖酸中的脂肪族C对真菌活性抑制率有正效应，而芳香族组分和异头C对真菌活性抑制率有负效应。 3)本章内容测定了腐殖酸对R.solani体外生长时的抑制率、菌丝的形态特征、转录组水平unigenes表达量变化以及培养体系中总体自由基信号强度。结果发现，腐殖酸添加以后，菌丝的侧枝生长增加、呈现立体式生长且出现皱缩现象。经统计分析，检测到175条差异表达基因(DEGs，differentially expressed genes)，含有111条上调unigenes和64条下调unigenes。进一步的功能注释和富集分析得到上调unigenes被注释并显著富集到维生素B6代谢、ABC转运子、谷胱甘肽(GSH，glutathione)代谢;而下调unigenes被注释到碳水化合物代谢的分子过程中，但未达到显著富集水平。结合实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR，real time-quantitative polymerase chain reaction)的结果，腐殖酸的添加导致R.solani体内与己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6P，glucose-6-phosphate isomerase）、谷胱甘肽合成酶（GSS，glutathione synthase）、谷胱甘肽还原酶（GSR，glutathione reductase）相关的unigenes相对表达量显著下降，下调比例分别为60.03％、70.70％、60.33％和57.59％;而编码谷胱甘肽S-转移酶(GST，glutathione S-transferase)的unigenes显著上调，上调倍数为2.66倍。电子顺磁共振（EPR，electron paramagnetic resonance）的结果显示腐殖酸能够诱导R.solani培养体系中总自由基信号的显著增加，峰高增效为59.56％。通过相关性网络分析，羰基C与腐殖酸诱导的DEGs之间的关联最多，为70条连接边，故羰基C是腐殖酸抑制效应的活性成分。 4)将风化煤腐殖酸和藓类泥炭腐殖酸按不同浓度添加至不同花生种植年限的土壤中，进行室内恒温培养，对土壤真菌ITS(Internal Transcribed Spacer)进行Illumina MiSeq PE300测序。非参数多因素方差分析(PerMANOVA，permutational multivariate analysis of variance)方法得到种植年限、培养时间、腐殖酸类型以及腐殖酸添加量对土壤真菌群落结构均存在显著影响。种植年限不同导致土壤真菌群落组成以及功能营养型群落组成产生显著差异。。培养时间显著改变土壤真菌群落的同时，使得其alpha多样性指数（observed_otu和shannon）显著降低。PerMANOVA分析得到:腐殖酸类型对花生种植6年的土壤真菌群落结构有极显著影响，而对种植1年和10年的土壤真菌群落结构无显著影响。另外，由FUNGuild功能注释得到的植物病原菌(plant pathogen)所占真菌群落的相对丰度，在种植1、6年花生的土壤中随着腐殖酸添加量的增加均呈现显著降低，而在种植10年花生的土壤中虽然没有检测到显著性降低，但总体仍然有降低的趋势。 5)将腐殖酸和百菌清同时添加至F.oxysporum的培养体系中，运用菌丝体生长试验、血球计数板和等温微量热技术，测定各处理的抑制率、孢子体数量以及热量排放。结果得到:腐殖酸-百菌清处理较百菌清单独添加处理的IR显著提高了10.29％，相对增效为25.33％。在摇菌培养的14天后，腐殖酸-百菌清处理的孢子数最少，显著低于其他处理，而百菌清处理与对照之间孢子数无显著差异;表明腐殖酸延长了农药百菌清对F.oxysporum孢子数增加的抑制作用。等温微量热的测定结果表明，腐殖酸-百菌清处理的热排放曲线在监测的时间内接近直线;而百菌清处理在培养后期重新检测到热排放峰;腐殖酸处理的热功率-时间曲线与对照相近。而且，百菌清处理的最大热功率(Pmax)显著低于腐殖酸处理和对照，而最大热功率出现时间(Tmax)显著高于腐殖酸处理和对照;腐殖酸-百菌清处理的Pmax、整体发热量(Q)、生长速率常数(k)均显著低于其他处理，表明F.oxysporum生长代谢受到抑制的程度最大;鉴于腐殖酸处理与对照热排放曲线的各参数之间没有显著差异，表明F.oxysporum的生长代谢活性没有直接受到腐殖酸的显著抑制，但腐殖酸会促进百菌清对F.oxysporum的抑制作用。 总之，高S含量和活性成分（羰基C）将导致腐殖酸对土传病原真菌的高抑制率;有机和无机混合溶剂更有利于从风化煤中提取具有较高抑制率的活性组分;腐殖酸能够引起R.solani转录组水平上相关代谢途径中功能基因的表达，且能增加R.solani培养体系中的自由基信号强度;花生种植年限、培养时间、腐殖酸类型及添加量均能显著改变土壤真菌群落的组成及结构，且腐殖酸添加量对土壤真菌群落的FUNGuild功能注释亦有显著影响;腐殖酸可以显著提高农药百菌清对F.oxysporum的抑制作用，将腐殖酸作为百菌清的农药增效剂，能有效降低农药百菌清用量及延长其药效。综上所述，腐殖酸功能产品的开发应用在土传病害的绿色防控中具有广阔前景。
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