摘要
镉是一种广泛存在于环境和食品中的有毒重金属污染物，给人和动物健康带来严重的危害。肝脏是镉毒性侵害的主要靶器官，但目前关于镉暴露诱导禽类肝脏损伤的确切机制尚无定论。本论文从体内与体外两个方面探究镉致鸡肝毒性损伤的分子机理。体内试验部分以200羽1日龄雄性海兰白鸡为试验动物，随机分为4组(50羽/组)，分别饲喂90d的0mg/kg(Control组)、35mg/kg(L-Cd组)、70mg/kg(M-Cd组)和140mg/kg(H-Cd组)镉处理饲料。观察肝脏组织学和超微结构，检测肝脏镉蓄积水平、矿物质元素含量、血清肝功能指标、肝脏解毒代谢功能、炎症反应相关因子、NLRP3炎症小体、线粒体损伤、线粒体自噬水平。体外试验部分以鸡肝癌细胞系(LMH细胞)为研究对象，在培养体系中加入0、0.5、1或2μM的CdCl2，培养24h后，检测细胞活性、细胞形态、炎症反应相关因子、NLRP3炎症小体活化、线粒体损伤及线粒体自噬水平。随后在培养体系中添加线粒体自噬诱导剂CCCP进行干预染镉试验，检测细胞活性，NLRP3炎症小体活化、线粒体自噬水平等相关指标。研究结果如下: (1)体内试验结果: 1)利用生物信息学预测Parkin和PINK1结构与功能，制备了特异性强、免疫亲和性高的兔抗鸡Parkin和PINK1多克隆抗体，建立针对鸡肝细胞线粒体自噬相关的检测技术平台。 2)镉暴露导致鸡体重增长缓慢，鸡冠大小、胫骨长度、肝重量显著降低;肝细胞排列紊乱，Kupffer细胞增多，细胞核溶解、破碎，肝细胞线粒体肿胀、嵴结构消失;肝功能(AST、ALT、GGT、IBIL和TP)损伤，肝脏组织中氧化产物(MDA和H2O2)含量增加，总抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶活性(CAT、POD、T-SOD、Mn-SOD和CuZn-SOD)降低，表明镉暴露引起肝脏结构与功能改变，氧化应激发生，进而呈现显著的肝脏毒性作用。 3)镉暴露增加肝组织中镉蓄积量及Be、Ba、Na、V、Cr、Fe、Co含量，降低Ca、Ag、Cu、Zn、Mn、Se含量;抑制外源敏感性核受体(AHR、CAR和PXR)应答反应，导致CYP450酶系紊乱;35mg/kg镉暴露激活Nrf2介导的Ⅱ相解毒酶，140mg/kg镉暴露抑制Nrf2信号通路应答;降低P-GP和MRP1转录水平，表明镉暴露通过抑制核受体应答，导致CYP450酶系稳态失衡，抑制Ⅱ、Ⅲ相解毒代谢反应，减少镉的排出，导致镉蓄积于肝脏，扰乱肝脏组织中元素稳态，加剧镉的肝毒性效应。 4)镉暴露导致肝脏组织炎性细胞浸润，增加门管区纤维化水平，增加血清、肝脏促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-18)含量，降低抗炎因子(IL-10)含量，促进肝脏NLRP3炎症小体的活化及其下游因子(Caspase1、IL-1β和IL-18)的表达，表明镉暴露可通过活化NLRP3炎症小体诱导肝脏炎症反应，引起肝脏炎性损伤。 5)镉暴露导致线粒体结构损伤，线粒体膜电位下降，mtDNA拷贝数下降;线粒体生物发生和线粒体融合相关调控因子(SIRT1、PGC-1α、NRF1、TAFM、Mfn1、Mfn2)表达降低，线粒体分裂和线粒体自噬相关调控因子(MFF、Fis1、PINK1、Parkin、LC3、ATG3、ATG5、ATG9、Beclin-1)表达升高，表明镉暴露可损伤线粒体结构，干扰线粒体生物发生和动力学平衡，诱导肝脏发生线粒体自噬。 (2)体内试验结果: 1)镉暴露抑制LMH细胞活性，促进NLRP3炎症小体活化和炎性因子释放，导致细胞炎性损伤;同时，镉暴露损伤线粒体结构和功能，引发线粒体自噬，但随镉剂量增加，线粒体自噬活性有所下降，表明线粒体自噬和NLRP3炎症小体活化在镉致LMH细胞炎性损伤中发挥重要作用。 2)CCCP干预线粒体自噬反应后，抑制镉诱导的LMH细胞NLRP3炎症小体活化、炎性因子释放和细胞活性降低，表明线粒体自噬可调控NLRP3炎症小体活化，缓解镉诱导的肝细胞毒性。 综上所述，镉暴露可破坏肝脏元素稳态，抑制肝脏解毒代谢功能，引起肝脏氧化应激，活化NLRP3炎症小体，导致肝细胞炎性损伤;同时，镉暴露可引起肝细胞线粒体损伤和线粒体自噬;增加线粒体自噬水平可抑制肝细胞中NLRP3炎症小体活化，缓解镉诱导的肝细胞炎性损伤。本研究证实线粒体自噬通过清除受损的线粒体，抑制NLRP3炎症小体活化，缓解镉诱导的肝脏炎性损伤。
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