摘要
牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的牛的一种热性传染病，呈世界性分布，OIE将其列为B类动物疫病，在我国属于二类传染病。该病临床症状多样，主要表现为发热、腹泻、消化道黏膜发炎、糜烂和坏死、肺炎等炎症反应，且可造成牛的持续性感染，严重影响牛的生产性能，是危害养牛业发展的主要传染病之一，造成了巨大的经济损失。核转录因子κB(NF-κB)广泛存在于体内各组织细胞中，作为一种重要的转录调节因子调控多种细胞因子和炎性介质的基因表达，参与机体炎症反应过程。此外，NLRP3炎症小体作为NLRs家族的重要成员，在炎症性疾病的发生发展中发挥着重要作用。BVDV感染引起的机体炎症反应是否与通过NF-κB途径激活NLRP3炎症小体有关？哪种病毒蛋白起关键作用？这些问题有待进一步研究。基于上述问题的考虑，本研究从病毒水平检测BVDV对NF-κB信号通路激活的以及NLRP3炎症小体活化的影响，进一步筛选激活NF-κB信号通路的主要病毒蛋白并确定其关键功能域，为解析BVDV感染诱发炎症反应的机制提供线索。 第一部分，以原代BT细胞为模式细胞，从病毒水平检测了BVDV感染对NF-κB信号通路的激活作用以及NLRP3炎症小体的活化情况。具体内容与结果如下:利用双荧光素酶报告系统检测了BVDV感染BT细胞后对NF-κB信号通路的影响，结果显示，BVDV感染可显著激活BT细胞NF-κB信号通路，且激活效果与病毒滴度呈正相关;进一步采用间接免疫荧光方法检测了BVDV感染BT细胞后p65在细胞内的定位情况，结果显示，BVDV感染促进了p65向细胞核内转移;采用RT-qPCR方法检测了NF-κB信号通路激活后NLRP3炎症小体各组分NLRP3、Caspase-1和ASC的mRNA表达水平，结果显示，NLRP3、Caspase-1和ASC的基因表达水平显著升高，表明NLRP3炎症小体被激活;最后，采用RT-qPCR方法检测了IL-6、IL-8、IL-1β等炎症相关因子的基因表达水平，结果显示，上述炎症因子的基因表达水平显著升高。 第二部分，筛选出了具有显著激活NF-κB信号通路活性的BVDV蛋白。具体内容与结果如下:分别构建BVDV蛋白C、E0、E1、E2、Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(分a段和b段)的真核表达载体，分别转染BT细胞和293T细胞，采用Westernblot方法和IFA检测蛋白表达效果，结果显示，目的蛋白在BT细胞和293T细胞中均获得成功表达;利用双荧光素酶报告系统检测了病毒蛋白在BT细胞和293T细胞中激活NF-κB信号通路的情况，结果显示，BVDV蛋白C、E0、NS4B、NS5A在BT细胞能显著激活NF-κB信号通路，E0、NS4B、NS5A在293T细胞能显著激活NF-κB信号通路。 第三部分，选择在BT细胞和293T细胞中均有显著激活NF-κB信号通路活性的E0和NS5A蛋白分析其对NF-κB信号通路中关键因子IκBα和p65的影响，并确定其激活NF-κB信号通路的关键氨基酸区域。具体内容与结果如下:BT细胞转染表达E0和NS5A蛋白的真核质粒后，分别采用Westernblot和IFA方法检测E0和NS5A蛋白对细胞中IκBα和p65的影响，结果显示，E0和NS5A蛋白可促进IκBα降解以及p65磷酸化和核转移，表明E0和NS5A蛋白可通过经典途径激活NF-κB信号通路，其中E0蛋白1-94位氨基酸和NS5A蛋白212-496位氨基酸是激活NF-κB信号通路的主要功能区域。 综上，BVDV感染可激活NF-κB信号通路，进而介导NLRP3炎症小体活化，其中BVDV结构蛋白E0和非结构蛋白NS5A对激活NF-κB信号通路起主要作用。本研究结果为深入解析BVDV感染引起机体炎症反应的致病机理提供依据。
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