摘要
蜡质层作为植物与环境直接接触的一道屏障，在植物抵御逆境方面发挥着重要作用；表皮蜡质的有无既可以作为一种形态学标记应用于育种，也可以作为作物抗性育种的选育目标。但蜡质种类繁多，成分复杂，为油菜蜡质组分的遗传改良及以此为基础的抗逆育种带来了挑战。本研究对两个甘蓝型油菜光叶突变体Nillaglossy2(ngl2)和zs11-e进行了遗传分析，发现ngl2光叶表型受2对隐性基因控制，而zs11-e光叶表型受1对隐性基因控制，通过图位克隆的方法，成功克隆到了其造成蜡质缺陷的3个基因，并分析了这些基因在甘蓝型油菜蜡质合成中的功能，主要结论如下： 1)两个突变体ngl2和zs11-e的茎、叶片、花蕾及角果蜡质表型都存在异常，且全生育期表型稳定。扫描电镜检测结果显示突变体叶片表面柱状，管状，丝状等蜡质晶体种类显著减少，片状晶体增多，片状晶体平铺在表皮表面形成光叶表型。通过气相色谱质谱联用分析叶片表皮蜡质发现ngl2突变体中支链初级醇含量显著降低，支链烷烃成分显著升高，因此我们推测ngl2中突变基因与脂肪醇合成相关；在zs11-e突变体中也发现支链初级醇，支链烷烃含量都降低，而直链蜡质组分都有升高的趋势，所以我们推测zs11-e中突变基因可能参与蜡质从头合成。 2)遗传分析发现ngl2光叶表型受2对隐性基因控制，通过图位克隆的方法，利用BC3群体将其中一个基因定位在A1染色体约50kb的区域，另一个基因定位在C1染色体230kb的区段，然后通过比较测序和基因注释，筛选到两个基因BnA1.CER4(BnaA01g03200D)和BnC1.CER4(BnaC01g04460D)，转基因验证这两个基因能恢复ngl2表型。亚细胞定位结果显示BnA1.CER4和BnC1.CER4都定位在内质网上，在叶片中BnA1.CER4比BnC1.CER4表达量高，而在茎中BnC1.CER4比BnA1.CER4表达量高，两者在角果和花蕾中表达量较低，而在根中两个基因都完全不表达。 3)酵母异源表达BnA1.CER4和BnC1.CER4虽然能够检测到C26脂肪醇，但含量很低，说明BnA1.CER4和BnC1.CER4可能对支链底物具有偏好性。 4)检测失水率和核盘菌抗性发现ngl2突变体失水率变快，但对核盘菌抗性增强。 5)遗传分析发现zs11-e突变体表型受一对隐性基因控制，构建BC5回交群体，利用油菜60k芯片结合SSR标记将目标基因定位在A08染色体0-1M的区间内，分子标记显示目标区段存在大片段缺失；进行RNA-seq测序，将候选基因缩小到46个，结合表型找到一个基因Bn.BCDH1(BnaA08g00430D)，Bn.BCDH1是支链α酮酸脱氢酶复合体的一个亚基，转基因验证发现Bn.BCDH1能互补zs11-e表型。 以上结果表明，BnA1.CER4、BnC1.CER4和Bn.BCDH1都参与了油菜支链蜡质的合成，对维持油菜正常表皮蜡质结构与功能至关重要。这些研究为将来利用育种策略修饰蜡质组分改善油菜抗逆性奠定了理论基础。
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