摘要
目的: 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)，也称绿脓杆菌，不仅是常见的条件致病菌之一，也是引起医院内感染大爆发的主要致病菌之一。亚胺培南是临床上治疗铜绿假单胞菌感染的常见药物，随着它在临床治疗中的广泛使用，出现越来越多的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，IRPA)，导致其引起的感染性疾病的治疗越来越困难，已经成为临床治疗的一个重大挑战。本课题通过研究我院分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药情况，检测其金属β-内酰胺酶的产生、主动外排系统的表达以及外膜蛋白OprD2的缺失，从整体上了解铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制，为临床上合理、有效的应用抗生素提供参考依据。 方法: 1.耐亚胺培南铜绿假单胞菌的MIC值测定及金属β-内酰胺酶基因(MBL)的检测: 收集从2011年9月至2013年6月从本院临床标本中分离出的铜绿假单胞菌，用ATBexpression半自动细菌鉴定仪和VITEK-2全自动细菌鉴定和药敏分析系统对收集的标本进行鉴定和药敏分析，以2012年美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的标准作为参考标准，用琼脂平皿二倍稀释法测定铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的MIC值。通过K-B纸片扩散法在亚胺培南(IMP)药敏纸片上加入金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)来筛选产MBL基因表型阳性菌株，用煮沸法提取细菌DNA并用PCR扩增法检测金属酶基因IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SPM及GIM等基因，了解我院铜绿假单胞菌金属酶的产生情况。 2.耐亚胺培南铜绿假单胞菌主动外排系统的检测: 将上述收集好的耐亚胺培南铜绿假单胞菌用煮沸法提取细菌DNA并用PCR扩增法检测主动外排系统相关基因如OprM、mexA、mexB、mexC、mexD、mexE、mexF及mexX基因，以了解我院铜绿假单胞菌是否有主动外排系统的表达及主要携带类型。 3.耐亚胺培南铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2的基因及蛋白检测: 将第一部分所述的耐亚胺培南铜绿假单胞菌以煮沸法提取DNA并用PCR扩增法检测外膜蛋白OprD2基因，以了解我院铜绿假单胞菌是否有外膜蛋白OprD2基因缺失的情况。用细菌膜蛋白提取试剂盒提取细菌的膜蛋白并用SDS-PAGE电泳法检测外膜蛋白OprD2的表达情况，外膜蛋白OprD2的位置通过水杨酸钠抑制试验来确定。 结果: 1.本次研究共收集到临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌145株，其中痰标本占65.5％(95/145)，分泌物标本占17.2％(25/145)，其余17.3％来自其他各种标本如尿液、脓液、血液、胆汁和组织标本等;从科室分布来看，重症监护病房(ICU)占的比重最大，为37.9％(55/145)，其次是烧伤整形病房，为17.9％(26/145)，呼吸内科和儿科各占6.9％(10/145)，其余标本来自其他病房。本次收集的耐亚胺培南铜绿假单胞菌对亚胺培南的MIC值均大于等于8μg/ml(耐药)，对于美罗培南，除有7株细菌对美罗培南的MIC值等于4μg/ml(中介)外其余均大于等于8μg/ml(耐药)。 2.在145株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中，有53株为产MBL表型阳性株，占所有试验菌株的36.6％。经PCR扩增发现，在145株IRPA菌株中有46株携带有MBL基因，分别为VIM-1基因阳性13株，VIM-2基因阳性20株，SPM基因阳性13株，其它基因扩增后为阴性结果。 3.在收集到的145株IRPA细菌中，共检测出16株携带主动外排基因OprM，且在这16株中有12株还携带mexA和mexB基因，即有12株携带mexAB-OprM外排系统，有4株只携带OprM基因;其余实验菌株未检出外排基因。 4.在本次研究的145株IRPA细菌中，PCR检测有115株未获得OprD2基因产物;在SDS-PAGE检测中有115株在45KD处未出现OprD2蛋白条带，外膜蛋白OprD2缺失率为79.3％，与OprD2基因缺失情况相吻合，铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853及IMP敏感株未发现OprD2基因及蛋白缺失。 结论: 1.在我院各病房分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌中，分离自痰标本的比例最高，占65.5％;其次是伤口分泌物，占17.2％。从科室分布来看，重症监护病房(ICU)占的比重最大，为37.9％;其次是烧伤整形病房，为17.9％。 2.外膜蛋白OprD2的缺失是我院介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。 3.金属β-内酰胺酶的产生是本院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制之一，菌株携带的β-内酰胺酶基因主要有VIM-1、VIM-2和SPM。 4.外排系统MexAB-OprM的存在是我院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制之一。 5.两种金属β-内酰胺酶基因同时存在、金属β-内酰胺酶与外排系统MexAB-OprM或外膜蛋白OprD2缺失并存时，能介导铜绿假单胞菌对亚胺培南的高度耐药。
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