摘要
L-乳酸作为重要的塑料替代品聚乳酸的单体，需求量十分巨大。大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于进行基因工程改造、发酵周期较短和营养要求简单等优点，近年来，在L-乳酸生产中扮演了重要角色。但是，相对于其它菌株，大肠杆菌发酵获得的L-乳酸的产量相对较低。这是由于大肠杆菌在发酵过程中受到高浓度葡萄糖的阻遏及产物乳酸的抑制，限制了其L-乳酸产量的提升。本实验室前期构建了一株能利用无机盐培养基产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L，本文拟通过耐乳酸盐的驯化及补料分批发酵等手段，提高大肠杆菌的L-乳酸产量及糖酸转化率，研究结果如下： (1)以E.coliHBUT-L为出发菌株，利用2%~12%乳酸盐对其进行28代驯化，得到菌株E.coliHBUT-L16。E.coliHBUT-L16利用16%葡萄糖进行分批发酵时，其生物量和乳酸产量相对于出发菌株分别提高了80.2%和29.6%。 (2)进一步研究了不同中和剂对E.coliHBUT-L16发酵效果的影响。利用10%的葡萄糖进行发酵，以Ca(OH)2作中和剂时，E.coliHBUT-L16的L-乳酸产量及生产强度分别为98.23g/L和3.51g/(L·h)；以KOH为中和剂时获得的L-乳酸产量及生产强度分别为95.19g/L和2.64g/(L·h)。以NH4OH作为中和剂时获得的L-乳酸产量及生产强度最低，分别为81.27g/L和1.69g/(L·h)。 (3)对E.coliHBUT-L16采用补料发酵的方式来缓解高浓度葡萄糖的阻遏效应。结果表明，采用8%+8%+4%葡萄糖进行补料发酵，乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为186.8g/L、42h、93.4%、4.45g/(L·h)，L-乳酸光学纯度达到99.6%，相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵，乳酸产量和糖酸转化率分别提高了24%和23.6%，发酵周期缩短了一半以上。 (4)对以海藻酸钠为载体的五种包埋方法的固定化效果进行了比较，最终确定海藻酸钠包埋法为最合适的包埋方法。通过正交实验对海藻酸钠包埋法固定E.coliHBUT-L16产乳酸的条件进行优化。优化结果为：海藻酸钠浓度2%，CaCl2浓度3%，硬化时间4h。在此条件下固定化E.coliHBUT-L16进行发酵，获得39.56g/L的L-乳酸产量，与单因素优化结果相比，L-乳酸产量提高了7.7%。固定化胶珠在摇瓶发酵中重复利用9次，乳酸产量仍保持在38.27g/L。
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