摘要
粘虫Mythimnaseparata隶属于昆虫纲(Insecta)鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是一种世界性的农业迁飞害虫。种群密度影响粘虫迁飞能源物质甘油三酯的合成，群居型成虫的甘油三酯含量高于散居型，群居型粘虫更适合远距离迁飞，危害范围更广。已有文献报道，视黄醛脱氢酶(Retinal dehydrogenase， RALDH)调控小鼠Musmusculus体内甘油三酯的合成。RALDH基因是否响应粘虫种群密度调控甘油三酯合成的研究少有报道。因此，依据候选基因法，探究RALDH基因对粘虫幼虫甘油三酯合成的影响，以期为阐明粘虫迁飞机制提供基础数据，同时为粘虫的防治工作提供理论基础。 本研究运用GPO-PAP酶法，测定了两种生活型(散居型：1头/瓶；群居型10头/瓶)4龄、5龄和6龄粘虫幼虫甘油三酯含量；运用RACE和RT-qPCR技术，克隆获得了粘虫RALDH基因cDNA全长序列并建立了RALDH表达模式；进一步应用植物介导昆虫RNAi技术，探讨了RALDH基因对粘虫幼虫甘油三酯合成的影响。 1.基于转录组数据，分析甘油三酯合成通路。本研究利用IlluminaHiSeqTM2000高通量测序平台对粘虫散居型(MS)与群居型(MG)5龄幼虫进行转录组测序并建立数据库。结果显示，每个样品的转录组数据量约为8.76Gb，所有样品的碱基正确率(Q20)均高于98%，GC含量在51.29%-53.04%之间。使用Trinity软件组装cleanreads，使用Trinity软件组装cleanreads共获得58094条unigenes，与Nr、Swissport、KOG和KEGG数据库中比对，共注释30184(51.96%)条unigenes。通过对转录组数据分析发现，在群居型的甘油三酯代谢通路上RALDH基因上调表达，推测该基因响应种群密度影响甘油三酯的合成。 2.两种生活型粘虫幼虫甘油三酯含量测定。利用甘油三酯(TG)GPO-PAP酶法，测定两种生活型4龄、5龄和6龄粘虫幼虫甘油三酯含量。结果显示，群居型粘虫幼虫甘油三酯含量均高于散居型，且甘油三酯含量随幼虫龄期的增长而增加。散居型4龄幼虫甘油三酯含量(0.774±0.01mmol/L)与群居型(0.8165± 0.03mmol/L)无显著性差异(P>0.05)；群居型5龄(1.508±0.05mmol/L)和6龄(2.015±0.03mmol/L)幼虫甘油三酯含量均显著高于散居型5龄(1.232±0.01mmol/L)和6龄(1.596±0.04mmol/L)(P<0.05)。 3.RALDH基因的克隆与生物信息学分析。根据RALDHunigene序列，设计克隆RALDH全长cDNA序列所需引物；利用RACE和RT-qPCR技术，扩增RALDH基因cDNA5’端与3’端序列，通过ContingExpress?软件对所获的5’端、3’端及unigene序列进行拼接，获得粘虫RALDH基因全长cDNA序列。结果显示，RALDH基因全长cDNA序列为1901bp，开放阅读框(ORF)长度为1461bp，编码一条含486个氨基酸残基组成的肽链。起始密码子ATG位于第99-101位核苷酸，终止密码子TAA位于第1557-1559位核苷酸。5’非翻译区(5’-UTR)长度为98bp，3’非翻译区(3’-UTR)长度为342bp。编码的蛋白质分子量为52.382KDa，理论等电点为5.98。对该蛋白质的结构域鉴定发现，该蛋白属于醛脱氢酶超家族(ALDH super family)。同源序列比对显示，RALDH基因与棉铃虫HelicoverpaarmigeraRALDH的相似度达到83.74%，与斜纹夜蛾SpodopteralituraRALDH基因相似度有82.72%。表明确定克隆获得的序列为粘虫RALDH基因全长cDNA序列。 基于RALDH蛋白氨基酸序列，利用MEGA7.0软件采用邻接法(Neighbor-joining)对粘虫和其他12种昆虫RALDH蛋白氨基酸序列进行比对构建系统发育树。结果显示粘虫与斜纹夜蛾S.litura聚在同一分支且bootstrap值为87，表明这两个种遗传距离最近。 4.粘虫幼虫RALDH基因的表达模式。 (1)幼虫各组织中RALDH基因的表达模式。应用RT-qPCR技术测定RALDH基因在5龄幼虫头部、表皮、前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管中mRNA的表达情况。结果显示，粘虫RALDH基因在不同组织中均有表达，脂肪体中RALDH基因mRNA水平极显著高于其他组织(P<0.01)，马氏管、前肠和中肠次之，头部表达量最低。 (2)两种生活型粘虫幼虫RALDH基因的表达模式。应用RT-qPCR技术测定两种生活型4龄、5龄和6龄粘虫幼虫RALDH基因mRNA的表达水平。结果显示，群居型RALDH基因mRNA表达量高于散居型，mRNA水平随幼虫龄期的增长而增加。两种生活型4龄幼虫RALDH基因mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)；群居型5龄和6龄幼虫RALDH基因的表达量均显著高于散居型(P<0.05)。 5.RALDH基因对粘虫甘油三酯合成的影响 (1)玉米介导粘虫RNAi体系的建立。根据RALDH基因序列确定其干扰靶标片段，设计5’端引入BamHI(CGGGGATCC)和KpnI(CGGGGTACC)酶切位点的上下游特异性引物，利用RCR技术扩增干扰片段。用pTRV2作为表达载体，将400bpRALDH基因干扰片段与pTRV2载体重组形成pTRV2-RALDH质粒。通过农杆菌GV3101介导，将pTRV2-RALDH和pTRV2-GFP重组质粒(实验室提供)菌液分别与pTRV1质粒菌液按1:1比例混合，通过真空渗入法分别转化玉米胚芽，使玉米表达RALDH-dsRNA和GFP-dsRNA。测定饲喂含有RALDH-dsRNA和GFP-dsRNA的玉米植株粘虫的RALDH基因mRNA的表达量及干扰后粘虫幼虫甘油三酯含量。结果显示，饲喂空白组与表达GFP-dsRNA阴性对照组幼虫相比，RALDH基因mRNA的表达量无显著性差异(P>0.05)；饲喂RALDH-dsRNA的实验组4龄、5龄和6龄幼虫RALDH基因mRNA的表达量均显著降低(P<0.05)，表明玉米介导粘虫RALDHRNAi产生沉默效果。 (2)粘虫甘油三酯含量的测定。利用甘油三酯GPO-PAP酶法测定空白组、阴性对照组(GFP-dsRNA)和实验组(RALDH-dsRNA)的甘油三酯含量。结果表明，空白对照组甘油三酯含量与阴性对照组相比差异无显著性，实验组4龄幼虫甘油三酯含量与对照组相比无显著差异(P>0.05)，实验组5龄和6龄幼虫甘油三酯含量显著低于对照组(P<0.05)。表明饲喂粘虫含有RALDH-dsRNA的玉米植株，有效降低了粘虫体内甘油三酯含量。由此，我们推测RALDH基因对粘虫甘油三酯合成有调控作用。 综上所述，本研究利用RACE、RT-qPCR技术获得了粘虫RALDH基因cDNA序列及时空表达情况，通过寄主植物-玉米介导粘虫RNAi技术有效抑制粘虫幼虫RALDH基因的表达，其结果影响了粘虫幼虫体内甘油三酯含量，表明RALDH基因参与调控粘虫甘油三酯合成。
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