摘要
近年来，我国虾类养殖业发展迅速，市场的需求量也逐渐加大，造成在养殖过程中出现各种由细菌、真菌或病毒诱发的疾病，因此研究虾类的免疫应答极为重要。由于缺乏适应性免疫(Adaptive immunity)，虾类主要依靠先天免疫(Innate immunity)来防御入侵的病原体。先天免疫防御的启动是通过模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)识别或结合微生物表面的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)。富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeats,LRR)蛋白是一类进化上非常保守的模式识别受体，参与先天免疫的启动。本论文以日本沼虾和克氏原螯虾为实验材料，主要针对两种富含亮氨酸重复序列受体的免疫功能进行研究，包括日本沼虾的一个Toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)和克氏原螯虾的LRR-IG的性质进行研究，得到了以下结果： 一、日本沼虾中Toll受体介导抗细菌免疫机制研究 在本研究中，我们从日本沼虾中克隆得到了一个Toll样受体，并命名为MnToll1。MnToll1的cDNA完整序列长度为3807bp，其中开放阅读框(ORF)的长度为3012bp，编码1003个氨基酸。MnToll1蛋白含有12个LRR结构域，两个LRR_CT结构域，三个LRR_TYP结构域，一个跨膜结构域以及一个TIR结构域。系统发育分析发现MnToll1与来自罗氏沼虾的TLRs聚集在一起，且有72%的相似性。MnToll1的mRNA分布在所有被检测的组织中，在鳃中的表达量最高；用副溶血性弧菌刺激后，鳃组织中的MnToll1在所有选定的时间点(2、6、12和24小时)均上调表达，在12小时到达峰值。用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌刺激后，鳃组织中的MnToll1在24小时内显示出连续上调的表达模式。dsRNA处理干扰MnToll1降低其表达水平后，再经弧菌刺激，日本沼虾死亡率增加。而且干扰了MnToll1的日本沼虾体内三种抗菌肽基因ALF2，Cru1和Cru2的表达量下调。为进一步了解这个基因对细菌防御机制的研究，我们针对胞外区的LRR结构域构建了原核表达系统，并得到了重组蛋白rMnLRR，通过糖结合实验和细菌结合实验，我们发现rMnLRR可以与多种细菌结合，也可以高亲和力结合脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)。这些结果表明MnToll1可能作为模式识别受体直接识别细菌的入侵，并调节下游抗菌肽基因的表达。 二、克氏原螯虾LRR-IG免疫功能研究 通过对克氏原螯虾的转录组测序结果进行分析，我们得到了一个新的基因，将其命名为LRR-IG，LRR-IG的cDNA全长3742bp，开放阅读框为3045bp，编码1014个氨基酸，含有19个氨基酸的信号肽以及23个氨基酸的跨膜结构域，此外，它包含有九个LRR结构域和一个IG结构域。通过qPCR的方法对LRR-IG进行组织分布分析，结果显示该基因在各被测组织中都有表达，其中在鳃和肝胰腺中表达量最高；经嗜水气单胞菌刺激后，LRR-IG在鳃组织和肝胰腺中表达都有上调现象。在鳃组织中，第6小时就上调到最高表达水平；而在肝胰腺中，在第24小时上调到最高水平。该结果表明LRR-IG可能介导抗细菌免疫反应。我们已将LRR结构域和IG结构域分别在大肠杆菌系统中进行表达并纯化得到了重组蛋白，所得蛋白可进一步研究该基因与病原的相互作用的机制，以及引起下游的免疫反应机制。
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