摘要
研究背景 心房颤动(atrialfibrillation，简称房颤，AF)是临床上最常见的一种快速性心律失常，其发病率和致死率相对其他疾病较高。Framingham流行病学研究表明，房颤的人群患病率达到0.5％，且随着年龄的增长，在60岁及80岁以上人群中，房颤的患病率分别上升到6％和8.8％。长期房颤可引起严重的并发症，房颤患者的心力衰竭发生率较正常人群增加3倍，卒中的发生风险是正常人群的5倍。目前临床上针对房颤的主要治疗手段包括内科药物治疗、外科迷宫手术以及导管射频消融等，尽管这些治疗手段具有相应的疗效，但也有各自的弊端，如药物难以耐受、手术创伤大、复发率较高等，进而难以完全满足房颤患者的治疗需求。 房颤是由多种内部及外部因素共同作用引起的疾病，发病机制十分复杂，目前研究认为，心房重构是房颤发生和维持的重要基础。房颤时的心房重构主要包括心房电重构、结构重构以及神经重构。在房颤发生的早期，心房重构主要表现为离子通道和电生理的变化，也就是心房的电重构。其中离子通道的变化主要包括L型钙电流(ICaL)密度减少、内向整流钾电流(IK1)密度增加及缝隙连接半通道异常分布。电生理变化则主要表现为心房有效不应期(ERP)缩短以及动作电位时程(APD)的缩短。针对房颤心房电重构机制的深入研究，有助于进一步改善房颤的防治。 长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)是一类长度从200nt到100kb、没有蛋白质编码潜能的异质性转录本。大量研究表明，lncRNAs可能参与多种生物学过程，包括细胞的增殖、分化以及细胞周期的调控和凋亡等。(功)能角度看，lncRNAs可以通过多种机制参与基因表达和细胞活动，包括染色质重塑、结合转录因子、竞争性结合microRNAs(miRNAs)、mRNA的选择性剪接和翻译调控等。研究发现，lncRNAs的调节失调与包括心肌梗死、扩张型心肌病、心力衰竭等在内的许多心脏疾病有关，这表明它们有可能成为治疗的靶点和/或生物标志物。然而，关于lncRNAs在房颤中的潜在作用及机制的研究相对较少。 本研究拟探究lncRNAs在房颤发生中的作用及机制。研究分为两部分，第一部分首先通过心房快速起搏建立实验性房颤兔模型，通过对房颤及对照组兔心房肌行二代高通量测序，筛选出差异表达的lncRNAs及mRNAs，并进行生物信息学分析，进一步筛选出与心房电重构相关的lncRNAs。选定目标lncRNA后，通过功能获得及功能缺失实验，研究目标lncRNA在房颤中的作用。第二部分则通过生物信息学分析及数据库预测目标lncRNA可能的作用机制，然后通过一系列的体内及体外实验，确定目标lncRNA发挥作用的具体机制，以期为房颤的分子发病机制及寻找潜在治疗靶点提供线索与依据。 第一部分LncRNAs在实验性心房颤动中的作用研究 研究方法 1.兔右心房快速起搏建立实验性房颤动物模型 12只正常成年新西兰大白兔随机分为房颤组和对照组(n=6)，房颤组通过右侧颈静脉植入心脏起搏器(600次/分)持续快速起搏，对照组仅植入起搏器，不进行起搏，7天后检测各组心房ERP及房颤诱发率。 2.二代高通量测序筛选差异表达的mRNAs和lncRNAs 分别提取两组兔右心房肌的总RNAs进行二代高通量测序，检测各组mRNAs及lncRNAs的表达量，筛选出存在显著差异表达的mRNAs和lncRNAs。 3.生物信息学分析筛选与房颤心房电重构相关的目标lncRNA 对差异表达的mRNAs行GO(Gene Ontology)富集分析与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，并在此基础上对差异表达的lncRNAs进行靶基因预测、共表达分析、组织特异性分析等，综合所有结果筛选出与心房电重构相关的显著差异表达目标lncRNA。 4.构建目标lncRNA的过表达及沉默慢病毒并进行体内感染 将lncRNATCONS-00106987的shRNA克隆到慢病毒表达载体中，同时合成过表达lncRNATCONS-00106987的慢病毒，使用阴性对照慢病毒控制脱靶效应和非特异性效应。新西兰大白兔15只随机分为3组，开胸后将1×107个对应病毒颗粒注射到心房10个不同部位。分别于感染前和感染后14天测定心房ERP和房颤诱发率。比较慢病毒感染前后心房电生理的变化。 研究结果 1.通过快速右心房起搏，成功建立了房颤兔模型。起搏7天后，房颤组心房ERP较起搏前显著缩短，房颤诱发率增加，而对照组心房ERP及房颤诱发率较之前无显著改变; 2.通过二代高通量测序，筛选出1364个差异表达的lncRNAs，其中1110个lncRNA转录本下调，254个lncRNA转录本上调，同时筛选出956个差异表达的mRNAs，其中395个下调，561个上调。通过对差异表达基因行GO及KEGG分析，以及对差异表达的lncRNAs行靶基因预测等，发现lncRNATCONS-00106987在房颤组表达量显著上调并初步推测与心房电重构相关，选取lncRNATCONS-00106987作为目标lncRNA进行深入研究; 3.对兔心房感染目标lncRNATCONS-00106987的过表达、沉默及阴性对照慢病毒后，lncRNATCONS-00106987过表达组在感染14天后心房ERP显著缩短，房颤诱发率明显增加;lncRNATCONS-00106987沉默组心房ERP较感染前延长，房颤诱发率下降;阴性对照组心房ERP及房颤诱发率较感染前无明显变化。 研究结论 1.实验性房颤兔右心房发生了电生理改变，心房肌中lncRNAs存在特征性表达; 2.房颤时心房肌中差异表达的mRNAs在特定的功能及通路上存在富集，差异表达的lncRNAs与差异表达的mRNAs之间存在广泛的共表达，提示lncRNAs可能以多种方式参与房颤的疾病过程; 3.LncRNATCONS-00106987在实验性心房颤动兔心房中表达增高，过表达lncRNATCONS-00106987可以缩短心房ERP，增加房颤的诱发率。证明房颤时心房肌中高表达的lncRNATCONS-00106987可以促进心房电重构的发生。 第二部分LncRNATCONS-00106987影响房颤心房电重构的机制研究 研究方法 1.对lncRNATCONS-00106987进行生物信息学分析，寻找潜在作用靶点 通过cis-、trans-靶基因预测及数据库比对等，寻找与lncRNATCONS-00106987存在共表达或共同结合位点等关系的靶基因及miRNA，分析lncRNATCONS-00106987通过何种机制发挥作用。 2.双萤光素酶报告基因验证作用靶点 将野生型和突变型KCNJ2的3'UTR及lncRNATCONS-00106987与miR-26可能的结合位点克隆到萤光素酶载体中。将萤光素酶载体分别与miR-NC或miR-26mimics共转染，使用发光检测仪检测各组萤光素酶的信号值。 3.LncRNATCONS-00106987过表达及沉默慢病毒体内体外感染 原代心肌细胞分别感染阴性对照慢病毒、TCONS-00106987过表达慢病毒、TCONS-00106987沉默慢病毒，感染完成后提取RNA及蛋白检测靶基因的表达量变化。 4.LncRNATCONS-00106987过表达及miR-26过表达慢病毒共同感染 将lncRNATOCNS-00106987过表达慢病毒及miR-26过表达慢病毒共同对原代心肌细胞及兔心房肌进行共同感染，检测感染前后心房电生理、靶基因变化，并使用膜片钳检测电流密度的变化。 研究结果 1.通过对lncRNATCONS-00106987序列全长进行数据库比对，发与心房电重构相关的基因KCNJ2是lncRNATCONS-00106987的邻近基因。且过表达lncRNATCONS-00106987后，KCNJ2的mRNA及蛋白表达量均上调，沉默lncRNATCONS-00106987后则相反，提示KCNJ2为lncRNATCONS-00106987的靶基因; 2.LncRNATCONS-00106987和KCNJ2都与miR-26存在相同的结合位点。双萤光素酶报告基因分析结果表明，miR-26抑制lncRNATCONS-00106987及KCNJ23'UTR野生型质粒报告基因产生的信号，而突变型TCONS-00106987和KCNJ23'UTR质粒的报告信号不受影响，表明miR-26可以通过我们预测的的(点)与lncRNATCONS-00106987及KCNJ2结合并发挥作用; 3.与阴性对照组相比，体内共同感染lncRNATCONS-00106987过表达及miR-26过表达慢病毒组，KCNJ2mRNA及蛋白表达量均无显著增加，心房ERP无显著缩短，房颤诱发率无显著上升;原代心肌细胞共同感染lncRNATCONS-00106987过表达及miR-26过表达慢病毒组，KCNJ2mRNA及蛋白表达量均无显著上调，膜片钳IK1电流密度无显著增加。表明lncRNATCONS-00106987竞争性结合miR-26调节靶基因KCNJ2的表达，参与心房电重构。 研究结论 1.KCNJ2的表达量受lncRNATCONS-00106987表达水平的调控，电重构相关基因KCNJ2是lncRNATCONS-00106987的靶基因; 2.双萤光素酶报告基因结果证明lncRNATCONS-00106987/miR-26与miR-26/KCNJ2之间相同的结合位点为三者之间相互作用的直接靶点; 3.过表达miR-26可以逆转lncRNATCONS-00106987过表达所引起的KCNJ2表达量上调及心房电生理的改变，证实房颤时心房肌中高表达的lncRNATCONS-00106987在体内及体外实验中均可通过竞争性结合miR-26，减弱miR-26对靶基因KCNJ2的抑制作用，上调KCNJ2的表达，从而促进心房的电重构，导致房颤易发。
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