黑色素瘤是一种起源于皮肤、黏膜、脉络膜黑色素细胞的恶性肿瘤。由于患者的存活率极低，曾一度被认为是最具侵袭性和治疗复发性的恶性肿瘤。研究发现40%~60%的黑色素瘤患者存在BRAF基因的突变，其中最常见的突变方式是BRAFV600E突变。维罗非尼(vemurafenib，PLX4032)是靶向BRAF突变的小分子生物抑制剂，在国际上是晚期黑色素瘤的一线治疗药物。而遗憾的是，PLX4032的有效性平均持续仅6个月，患者很快出现获得性耐药。研究发现产生获得性耐药最主要的机制是MAPK信号通路被重新激活，2015年美国FDA批准联合使用BRAF和MEK抑制剂阻断MAPK通路的2个关键位点来延缓耐药性的产生，但疗效仍然不明显。除了BRAF抑制剂导致的MAPK通路重新激活，约有30%的患者出现不依赖MAPK通路的耐药性。研究发现22%的耐药黑色素瘤中PI3K/AKT通路的上调。因此，研发一种新的治疗药物或者一种逆转PLX4032耐药的辅助治疗手段具有重要的临床意义。 吴茱萸碱(evodiamine，EVO)是一种天然的吲哚生物碱，是吴茱萸的主要生物活性成分之一，其抗肿瘤功效越来越多地被国内外学者所发现。有研究报道，吴茱萸碱在肺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤中均有着促凋亡、抗侵袭的作用；除此之外，EVO还可逆转结肠癌中由ABCG2所介导的药物抗性，也有报道表明EVO增加了胶质母细胞瘤对TRAIL的敏感性，而EVO对于耐药黑色素瘤细胞的相关研究却鲜有报道。因此我们提出假设，EVO能否在黑色素瘤细胞中发挥其抗肿瘤作用，其是否具有逆转PLX4032耐药的作用。本研究通过体内、外实验初步探讨了吴茱萸碱对黑色素瘤耐药细胞的影响及其机制，为解决黑色素瘤的耐药问题寻找新的思路，同时为拓展吴茱萸碱的临床应用提供实验依据。 目的 本文以黑色素瘤A375细胞株、耐PLX4032的A375细胞株(A375/R)和裸鼠皮下移植瘤模型作为体内外实验的研究对象，通过研究PLX4032单独或联合EVO对耐PLX4032黑色素瘤细胞增殖凋亡的影响，探究其逆转耐药可能的作用机制。 方法 第一部分：1)体外培养人黑色素瘤细胞A375及耐PLX4032的A375细胞株(A375/R)，CCK-8法分别检测PLX4032和EVO对两种细胞的细胞毒性作用差异，计算A375/R对PLX4032的耐药倍数；2)以IC10的EVO联合PLX4032作用于A375/R细胞，检测其对A375/R的耐药逆转作用，并根据以上结果，将后续实验分为四组：Control组、EVO组、PLX组、联合用药组；3)倒置显微镜下观察PLX、EVO单独或联合使用对黑色素瘤耐药细胞镜下形态的影响；4)运用克隆形成实验检测联合用药对细胞克隆形成能力及细胞增殖的影响；5)通过流式细胞术检测PLX联合EVO对黑色素瘤耐药细胞的凋亡和周期的影响；6)运用Hoechst32258检测联合用药后细胞的凋亡形态学改变；7)通过免疫荧光和Westernblot技术检测联合用药对周期和凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase3、CyclinA和CDK2)、p-Akt和p-NF-κB/p65等的影响。 第二部分：1)在BALB/c-nu鼠右下腋窝处接种A375/R细胞，构建皮下移植黑色素瘤模型，将其随机分为4个组：Control组、EVO组、PLX组、EVO+PLX组；2)按照分组连续灌胃给药24天，每3天对裸鼠的体重和瘤体大小进行测量并作好记录；3)待给药处理结束后，处死裸鼠，取瘤体称重并拍照；4)将瘤体组织进行石蜡切片、HE染色和免疫荧光染色，对各组瘤体组织的形态及p-NF-κB/p65的表达进行镜下观测；5)运用Westernblot对瘤体组织的凋亡相关蛋白及p-Akt和p-NF-κB/p65的影响进行检测。 结果 第一部分 1.CCK8检测结果显示：PLX4032对A375和A375/R细胞的半数抑制浓度IC50分别为2.21μmol/L和40.45μmol/L，A375/R对药物PLX4032的耐药倍数RI约为18.31；EVO对A375和A375/R细胞的半数抑制浓度IC50分别为4.94μmol/L、5.29μmol/L，其非细胞毒性剂量IC10均为0.5μmol/L；用EVO的非细胞毒性浓度0.5μmol/L处理A375/R后，PLX4032对A375/R细胞的IC50从40.47μmol/L降低到10.50μmol/L，逆转倍数RF为3.85，显示EVO能够逆转A375/R细胞的耐药并增强A375/R细胞对PLX4032的敏感性。根据以上结果，将细胞分为Control组、EVO组(0.5μmol/L)、PLX组(10μmol/L)、PLX+EVO组(10μmol/L+0.5μmol/L)进行后续实验。 2.细胞镜下观察显示：与Control组相比，联合用药后细胞贴壁能力减弱，成团生长，数量明显减少；克隆形成实验结果显示：与对照组相比，PLX组克隆形成率为35%，联合用药组克隆形成率为12.5%，提示EVO能增强PLX的抗增殖能力。 3.FCM检测细胞周期结果显示：EVO能够增强PLX4032对A375/R细胞周期的阻滞作用，更大程度地将细胞周期阻滞在S期；Westernblot结果显示：联合用药可以显著下调周期相关蛋白CyclinA、CDK2的表达。 4.FCM检测结果显示：对照组细胞凋亡率为5.24%，EVO组为6.74%，PLX4032组为18.84%，PLX4032联合EVO组为31.67%；Hoechst33258结果显示：联合用药能够促进细胞凋亡，增加细胞蓝色荧光强度，同时细胞出现明显的核固缩现象；Westernblot结果显示：联合用药可以明显上调Bax、Caspase-3的表达，下调Bcl-2的表达，提示联合用药能够显著促进细胞凋亡。 5.免疫荧光结果显示：与对照组相比，联合用药组细胞内p-NF-κB/p65的蛋白表达量明显减少，尤其细胞核内的p-NF-κB/p65蛋白水平降低更明显。Westernblot结果显示：与对照组相比，联合用药对Akt和NF-κB/p65的蛋白表达量未见影响，但能够显著下调磷酸化Akt、NF-κB/p65的蛋白水平。提示联合用药能够有效的抑制NF-κB/p65的磷酸化，并减少NF-κB/p65的核转移。 第二部分 1.对BALB/c-nu鼠体重进行称量，结果显示与对照组相比，加药处理对BALB/c-nu鼠体重的影响没有统计学差异；对BALB/c-nu鼠皮下移植瘤的瘤体大小进行测量，结果显示EVO组、Control组之间无明显差异，PLX组的瘤体体积略有减小，而联合用药组的瘤体体积则明显的减小，差异具有统计学意义(P＜0.05)。处死裸鼠，对瘤体进行称重，结果显示：与其它组相比，联合用药组瘤体重量明显降低。差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2.HE染色结果显示，对照组细胞排列规则，呈现均匀的淡紫色，而联合用药组细胞核深染，同时出现细胞皱缩，细胞间距明显增大；Weternblot结果显示：PLX组和联合用药组均能够增加Bax、Caspase-3的表达量，下调Bcl-2的表达量，但联合用药组的作用更为显著。 3.免疫荧光化学染色显示：与其它组相比，联合用药组细胞内p-p65的表达量明显减少，尤以细胞核内减少最为明显；Westernblot结果显示：联合用药组能够显著降低Akt和NF-κB/p65的磷酸化水平，且与PLX组相比有显著性差异。 结论 1.EVO能够有效抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时较低浓度EVO与PLX联合用药能够逆转黑色素瘤A375/R细胞耐药，并且诱导细胞凋亡、抑制细胞克隆形成能力，阻滞细胞周期在S期。 2.PLX4032联合EVO能够在体内有效抑制BALB/c-nu鼠瘤体生长。 3.EVO可能是通过下调Akt和NF-κB/p65的磷酸化水平来发挥其逆转耐药作用。
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