摘要
以苏打盐碱为主的土壤盐碱化严重影响作物的生长和发育，是制约农作物品质和产量的重要环境因素。盐碱土壤在Na+引发离子毒害与渗透胁迫基础上，增加了由HCO3-和CO32-导致的高pH伤害，能使土壤中的金属离子沉淀，影响植物对离子的有效吸收利用。同时，高pH胁迫能抑制植物根的正常生长。因此，挖掘作物耐苏打盐碱功能显著基因，解析其分子机制，对作物如何响应及调控苏打盐碱胁迫的分子机制的解析具有重要的意义。 野生大豆(Glycine soja L.)是栽培大豆(Glycine max L.)的野生近缘种，具有很强的耐盐碱能力。实验室前期通过耐苏打盐碱能力较强的野生大豆株系，获得了耐苏打盐碱胁迫关键调控因子GsERF71，并通过酵母文库筛选获得了其互作蛋白GsSMD。然而，GsSMD与GsERF71的相互作用及GsSMD基因的耐苏打盐碱功能尚未明确。针对上述问题，本研究从野生大豆中克隆出了GsSMD基因；通过酵母双杂交及双分子荧光互补实验(BiFC)验证了GsSMD与GsERF71的相互作用；利用Real-timePCR分析了GsSMD在碱胁迫下的表达模式；鉴定了GsSMD蛋白的亚细胞定位；进一步，通过过表达该基因于拟南芥中，分析了GsSMD基因的耐碱功能，及对ABA的敏感性，解析了GsSMD基因可能参与的信号途径。具体研究结果如下： (1)克隆获得了野生大豆GsSMD基因，GsSMD基因编码区全长为345bp，并构建了植物表达载体pCAMBIA2300-GsSMD。 (2)利用酵母双杂交技术，验证了GsSMD与GsERF71蛋白在酵母体内能相互作用；通过BiFC技术，利用重组农杆菌侵染烟草叶片，激光共聚焦观察黄色荧光信号，证实了GsSMD与GsERF71蛋白在植物细胞内存在相互作用。 (3)利用Real-timePCR技术检测GsSMD基因在碱胁迫应答过程中的表达量变化，结果表明GsSMD基因在碱胁迫应答过程中的表达量没有显著变化。将重组载体pCAMBIA1302-eGFP-GsSMD转入农杆菌后，侵染烟草，通过激光共聚焦显微镜观察绿色信号，结果显示GsSMD蛋白定位在细胞核中。 (4)利用拟南农杆菌侵染拟南芥花序法，获得GsSMD过表达拟南芥植株；对野生型(WT)拟南芥和转基因拟南芥进行碱或ABA胁迫处理，结果表明，GsSMD过表达拟南芥植株能提高对碱胁迫的耐受性，降低对ABA的敏感性。 (5)利用Real-timePCR技术，检测碱胁迫相关Marker基因和部分ABA信号通路基因的表达特性，结果表明在碱胁迫下，GsSMD过表达拟南芥植株中COR15A、KINI、COR47、H+-ATPase、NADP-ME和RD29A的表达量均出现显著变化，表明GsSMD基因可能通过以上Marker基因调控对碱胁迫的耐受性；ABA合成基因NCED3，及信号通路基因ABI1、ABI2、ABI4、ABI5、ABF4的表达量变化表明GsSMD可能参与了ABA信号转导途径。
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