摘要
免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡，也可损伤其免疫系统，导致机体抵抗力下降，并发或继发感染其他病原，造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒(CIAV)、马立克病病毒(MDV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒，在我国养鸡场中检出率较高，且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区，而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊，而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主，因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法，用于病原检测和临床诊断，同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测，建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法，并应用于临床检测中，以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况，并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。 1江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系，应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测，结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07％，CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09％、25.84％、10.85％和32.94％，CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61％、8.88％、1.18％和12.03％，二重感染以CIAV+ALV最为常见，检出率为7.69％，三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见，检出率为3.94％，四重感染检出率为0.99％。不同日龄鸡检测结果显示，6月龄以上鸡CIAV的检出率显著降低，3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示，蛋鸡MDV、REV检出率显著高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示，江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行，且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明，CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势(P＜0.01)。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸，MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96％、1.44％和3.35％，个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明，鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍，且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显著低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。 2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法，本研究根据MDVmeq基因、REVgp90基因和ALV-Jenv基因，合成特异性引物和TaqMan探针，建立和优化反应体系和条件，建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示，本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件，操作方便，检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J，与鸡其它主要病毒无交叉反应，特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL，敏感性较高，三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL，与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5％，重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测，两者的符合率为94.17％。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。 3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性，应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测，并同时进行病毒分离，然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性，REV和ALV-J核酸均呈阴性，病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了1株MDVⅠ型毒株，未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示，JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近，而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示，2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S，P194-)，具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y，V115A，T139A，P176R)，JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外，还与Js201801存在相同的突变(Q93R)，该突变其余参考毒株均未发生，这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外，JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变(V123A)和(A/P217T)，JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变(L98I，F240S)和(W67G，V210A)。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致，发病鸡均感染了马立克病毒，且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此，所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
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