摘要
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)是一种新兴的基因污染物，由于其在各类环境中分布广泛并且不易消除，对全球人类和环境有着潜在的健康和污染风险，因此近年来受到了人们广泛的研究和关注。污水处理厂(wastewater treatment plants，WWTPs)已经被证明是ARGs传播的重要场所。WWTPs的大部分生物处理过程主要依赖于活性污泥中的微生物。而好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge，AGS)作为WWTPs中一种重要且有着广泛应用前景的污水处理技术，已经受到了广泛的研究。AGS作为一种高密度微生物聚集体，在处理抗生素废水方面，相比传统活性污泥法，拥有较强的抵抗抗生素冲击的能力，尽管如此，不管是AGS的培养过程中，还是在AGS和抗生素相互作用的过程，对ARGs和AGS之间的关系以及相互作用等系统性的研究目前鲜有报道。评估AGS技术在ARGs方面的富集或去除性能，有助于进一步改善并促进AGS技术在实际工程中的应用。 本研究以AGS为研究对象，考察以实际生活污水为介质，在中试规模(75 m3)的序批式反应器(sequencing batch reactor，SBR)中以两种不同的培养方式培养AGS，揭示AGS培养过程中ARGs的命运，同时研究了ARGs在不同粒径AGS中的分布规律，以及在实验室小试SBR中，特定不同类型浓度抗生素的短期和长期影响下，AGS中ARGs的变化规律。采用高通量测序技术(Illumina MiSeq sequencing)，实时荧光定量PCR技术(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)以及高通量qPCR(high-throughput quantitative PCR，HT-qPCR)技术和多种统计学方法，对AGS中ARGs的消长和传播特征进行了系统研究。主要研究结果如下: 1)在中试规模(75 m3)的SBR中，分别以絮体活性污泥(flocculent activated sludge，FAS)((常规培养法(normalgranulation，NG))和接种破碎的AGS(强化培养法(enhancedgranulation，EG))两种方式启动并培养AGS。结果显示，NG(2016.9.12-2017.01.19)和EG(2017.02.16-2017.09.15)过程均成功培养出AGS，并且EG比NG过程能更快启动并培养出成熟AGS。NG过程AGS的形成的主要依赖于微生物作用(其贡献率为32.04％)。EG过程则更依赖于细菌群落与环境变量(操作参数和自适应变量)之间的相互作用(贡献率为73.16％)。EG过程中(glycogen-accumulating organisms，GAOs)类菌的明显富集(最高65.43％)，可能是导致其快速颗粒化的重要原因。这项研究表明，在常、中温季节以EG方式启动和培养AGS更合适，当AGS发生破碎失稳时，依然可以在后续的运行过程中重新形成成熟的AGS。 2)研究了在中试规模(75 m3)的SBR中，ARGs在NG和EG过程中的消长和传播特征。结果表明，EG过程(0.280±0.079)比NG过程(0.130±0.041)的ARGs平均相对丰度高，但EG过程中ARGs的富集强度(1.52-5.29倍)低于NG过程(3.79-75.31倍)。TnpA和intI1分别是NG过程(r=0.902，P＜0.050)和EG过程(r=0.823，P＜0.001)中携带ARGs的两种主要的移动元件(mobile genetic elements，MGEs)。与NG过程(17个宿主)相比，在EG过程中检测到了更高频率的水平转移(horizontal gene transfer，HGT)，并且检测到了更多可能的潜在携带有ARGs的细菌宿主(25个宿主)。总之，在用城市污水培养AGS的中试规模的SBR中，无论是NG还是EG过程，ARGs的积累和扩散都是不可避免的。 3)研究了中试规模(75 m3)AGS系统中，不同粒径AGS中ARGs的分布特征以及ARGs和AGS的物化特性、微生物群落之间的相关性。结果表明:处于1.26-1.60mm粒径范围内的AGS的颗粒密实度最大。该AGS体系中共发现了18种ARGs可能的潜在宿主，其中富集于絮体(＜0.20mm)和小粒径AGS(0.20-0.60 mm)中的丰佑菌属(Opitutus)和多种ARGs显著正相关，是一种具有多药抗性(multi-drug resistant，MDR)的抗性细菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)。絮体(＜0.20mm)和小粒径AGS(0.20-0.60 mm)中的intI1和磺胺类ARGs丰度最高，1.25-1.60mm粒径范围的AGS的总ARGs丰度最低。造成系统中ARGs变化的主要原因是ARGs之间的共选择机制。总的来说，对于此时的AGS系统，应尽可能将絮体和小粒径AGS(0.2-0.6 mm)筛除，以降低ARGs的丰度和传播风险，同时，应阻止AGS粒径增长过大，并对AGS系统进行磺胺类ARGs的针对性深度处理。 4)研究了ARGs对不同浓度恩诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生对AGS系统的短期冲击负荷后的响应。结果表明，恩诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生均在6000μg/L浓度时对AGS系统的氨氧化作用产生明显抑制。具有反硝化功能的菌如动胶菌属(Zoogloea)、陶厄氏菌属(Thauera)、PAO(Candidatus_Accumulibacter)以及亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)在磺胺嘧啶组中显著富集。气单胞菌属(Aeromonas)在三种抗生素实验组中均得到了显著富集，意味着这种菌具有多重耐药能力。三种抗生素导致了AGS中不同的ARGs迁移模式，并显著增加了各类ARGs和MGEs。三种抗生素对AGS中ARGs的变化由AGS中的微生物和环境因子的相互作用而导致。 5)研究了AGS长期暴露于高浓度思诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生中，AGS系统中ARGs的消长和传播特征。结果显示，高浓度的恩诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生(6 mg/L)对AGS系统中长期作用，改变了系统中ARGs的迁移模式。恩诺沙星和磺胺嘧啶系统中AGRs的总平均丰度远高于三氯生系统。三个系统中IntI1与总ARGs显著相关，是主要的MGEs，它通过HGT改变了整个ARGs的模式。恩诺沙星系统中的优势耐药菌(Flavobacterium)、磺胺嘧啶系统中的优势耐药菌(Candidatus_Competibacter和Defluviicoccus)和三氯生系统中的优势耐药菌(Defluviicoccus)被认为是EPS生产者，可能有助于减少ARGs。细菌群落、系统和水质参数以及MGEs之间的相互作用主要导致了恩诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生系统中不同的ARGs富集和传播模式。总体而言，应注意高浓度恩诺沙星、磺胺嘧啶和三氯生对AGS系统的影响，在中试或实际规模的AGS应用中试验更多类型制药废水对AGS的影响，以研究AGS技术的抗药性。
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